益肾化湿颗粒治疗大鼠糖尿病肾病中ERK表达及意义

赵毓芳　董科

[摘要] 目的 探讨益肾化湿颗粒在治疗大鼠糖尿病肾病中的ERK表达及其意义。方法 将40只SD（Sprague-Dawley）大鼠随机分为正常对照组（N组）、糖尿病肾病组（DN组）、益肾化湿颗粒治疗组（DN+Y组）、贝那普利治疗组（DN+B组）。对照组用等量柠檬酸缓冲液腹腔注射，糖尿病肾病组和各治疗组制备糖尿病模型，取血检测血糖（GLU）、血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量，以免疫组化方法检测各组肾组织p-ERK1/2表达及其意义。 结果 治疗后8周，DN组大鼠血糖明显升高，血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24h尿蛋白定量等指标与N组相比明显升高，二者差异有统计学意义（P<0.05）；DN组肾组织内p-ERK1/2的表达与N组相比明显增高，二者差异有统计学意义（P<0.05）；其他治疗组的血糖、SCr、BUN、24 h尿蛋白定量、p-ERK1/2表达等指标与DN组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 在糖尿病肾病的产生、发展过程中，ERK参与其中，其表达增加可能对DN的进一步发展造成影响；益肾化湿颗粒能够对DN大鼠肾皮质中ERK的活性予以有效限制，从而对DN肾脏起到一定的保护作用，这说明益肾化湿颗粒在糖尿病肾病的治疗中表达明显，具有较高的临床应用价值。

[关键词] 益肾化湿颗粒；糖尿病肾病；细胞外信号调节激酶

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2016）02（b）-0052-04

糖尿病是当前在临床上一种发生几率较高的慢性代谢性疾病，影响患者的日常生活，甚至对生命健康直接造成威胁，而糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN） 则是该病诸多并发症中最为严重的一种[1]。DH的临床症状集中变现为早期水肿、高血压，晚期肾功能损害[2]。由于目前糖尿病的发病率高居不下，且愈演愈烈之势，针对糖尿病肾脏疾病的临床研究与诊治已经刻不容缓，然而当前学界关于DN的具体发病机制依然没有达成一致共识。一般认为，DN的发生可能与包括细胞因子、糖脂异常代谢活动、生长因子等诸多综合因素的影响作用有关[3]。近年来的文献报道显示，胞外信号调节激酶（ERK）与DN之间存在密切关联；同时学界也开始尝试探讨益肾化湿颗粒在DN临床上的疗效及其病理表达[4]。该次实验通过研究益肾化湿颗粒治疗大鼠糖尿病肾病中ERK表达及意义，取得了一定成效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠 40 只，6～8周龄，体重（200±20）g。

1.1.2 试剂 p-ERK1/2 （Thr202/Tyr204）多克隆抗体。益肾化湿颗粒，广州康臣药业有限公司生产，生产批号040930，国药准字Z20090250，规格： 10 g/袋×9袋。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备与分组 40只SD大鼠饲养一周后，随机抽取10只为正常对照组（N组），喂养普通饲料；其余30只喂养高糖高脂饲料，30 d后予以腹腔注射50 mg链脲佐菌素（STZ）造成糖尿病模型，连续两次血糖≥16.7 mmol/L者即为造模成功。30只大鼠分为糖尿病肾病组（DN组）、益肾化湿颗粒治疗组（DN+Y组）、贝那普利治疗组（DN+B组）各10只。对糖尿病组和各治疗组制备糖尿病模型，对照组则用等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。成模后各治疗组大鼠每天分别用益肾化湿颗粒溶液[150 mg/（kg·d）]、贝那普利水溶液（浓度为0.11%）按10 mg/（kg·d）的剂量进行治疗性灌胃，对照组和糖尿病肾病组用等量生理盐水灌胃。所有大鼠实验期间均食用标准饲料，自由饮水，不使用胰岛素和其他降糖药物，连续观察8周后收集标本[5-6]。

1.2.2 标本留取 观察8周后称体重，留24 h尿，24 h 尿蛋白（mg） = 24 h尿量（mL）×尿蛋白含量（g/L）。经乙醚麻醉后，采血，抗凝分离血浆，留待检测。迅速打开腹腔，游离并摘除双肾，称取肾重，左肾去包膜后，切取10 mm3组织块，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃保存；常规石蜡包埋，4 μm切片，予以HE染色、PAS染色；切取1 mm3组织块，放入0.25%戊二醛溶液中，4 ℃保存[7]。

1.2.3 观察指标 P-ERK1/2表达、肾功能指标（包括血糖GLU、血清肌酐SCr、血清尿素氮BUN、24 h尿蛋白定量）。

1.3 统计方法

应用SPSS 19.0统计软件进行数据统计处理，以均数±标准差（x±s）表示计量资料，两组均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 对血糖（GLU）的影响

治疗8周后，DN组大鼠的血糖（22.17±1.03）mmol/L与N组（4.88±0.26）mmol/L相比明显升高，二者差异有统计学意义（P<0.05）；各治疗组大鼠血糖在数值上与DN组相比较低，但组组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。

2.2 对SCr、BUN、24 h尿蛋白定量的影响

治疗8周后，DN组大鼠的SCr（132.41±7.42）μmol/L、BUN（126.24±3.78）mmol/L、24 h尿蛋白定量（25.57±2.13）mg/24 h与N组相比明显升高，二者差异有统计学意义（P<0.05）；各治疗组大鼠SCr、BUN、24 h尿蛋白定量与N组相比明显降低，分组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；DN+Y组与 DN+B组相关指标对比分析，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 大鼠肾组织p-ERK1/2的免疫组织化学分析

治疗8周后，肾组织中p-ERK1/2阳性表达部位呈现明显的棕褐色或棕黄色颗粒，p-ERK1/2在各组大鼠肾小球和肾小管均有明显表达，p-ERK1/2 阳性表达主要位于肾实质细胞胞核及胞浆内，与N组相比，DN组4周（41.36±3.13）及8周（46.17±4.26）的pERK1/2 表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.01） ，其中8周表达较4周明显增加，差异有统计学意义（P<0.05） 。其他治疗组在第4、8周的p-ERK1/2与DN组相比差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

3 讨论

糖尿病是当前在临床上一种发生几率较高的慢性代谢性疾病，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN） 则是糖尿病中一种最为严重的并发症。当前学界关于DN的具体发病机制依然没有达成一致共识，这是由于DN的病因较为复杂。一般认为，DN的发生是多种因素综合作用的结果，包括肾脏血流动力学的变化、血管活性物质、细胞因子、糖脂异常代谢活动等，在多种因素的影响作用下，肾小球细胞中的信号转录通路会随之产生一定的变化[8-9]。目前学界已经逐渐认识到，在DN的发生与发展过程中，胞外信号调节激酶（ERK）通路的激活发挥着重要作用，国外已有学者证实了在糖尿病肾病肾纤维化的发生发展过程中，ERK1/2 的表达及其活化参与了整个过程。这说明，ERK在研究DN的发病机制方面具有重要的理论价值与参考意义。此外，近年来学界在DN的临床诊治研究进程中逐渐发现中药复方在治疗该病症上所具有的较高价值[10-11]，其中益肾化湿颗粒，经相关文献报道已经证实该药物治疗方式能够有效缓解DN患者的临床症状，通过对炎症予以及时抑制，进而帮助患者早日康复。然而，目前学界对于益肾化湿颗粒在治疗大鼠糖尿病肾病中的ERK表达及其意义相关问题依然缺乏深入、有效的研究分析。

ERK是细胞信号中对丝裂原信号进行传递作用中所需要的关键性激酶，当ERK被激活之后，通过转位到胞核的作用，ERK能够实现对于转录因子活性的有效调节，进而产生一系列的细胞效应。最新研究成果显示，ERK将系膜细胞激活之后，将会直接造成ECM分泌显著增加、细胞肥大，进而参与DN细胞的基质积聚活动。从中医的角度看来，糖尿病肾病的病因在于“肾气虚衰，消渴日久，气化失常”，因此采用中药复方的药物治疗方式，能够对肾组织ERK信号通路起到积极影响作用，通过影响肾脏MCP-1、 TNF-α mRNA水平达到对早期DN予以有效防止的效果[12]。

该次研究结果显示，DN组大鼠血糖（GLU）、血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量等指标与N组相比明显升高，二者差异有统计学意义（P<0.05）；其他治疗组的相关指标与DN组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。这说明，益肾化湿颗粒在治疗大鼠糖尿病肾病中具有ERK高表达，益肾化湿颗粒对于TGF-β1mRNA和PDGF-BmRNA的过度表达、肾脏肥大、细胞外基质极具等情况可能存在一定的下调影响，由于P-ERK1/2可能参与了早期DN的发生、发展进程，因此益肾化湿颗粒可能是通过对ERK的活性予以抑制来实现对于肾脏的保护作用。

综上所述，在糖尿病肾病的产生、发展过程中，ERK参与其中，其表达增加可能对DN的进一步发展造成影响；益肾化湿颗粒能够对DN大鼠肾皮质中ERK的活性予以有效限制，从而对DN肾脏起到一定的保护作用，这说明益肾化湿颗粒在糖尿病肾病的治疗中表达明显，具有较高的临床应用价值。

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（收稿日期：2015-11-06）