KSHV K15P慢病毒载体的构建及其滴度测定

许常青，陈 伟，方 圆，汪小五，王林定



KSHV K15P慢病毒载体的构建及其滴度测定

许常青1，2，陈 伟1，方 圆1，汪小五1，王林定1

目的 构建含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)ORF K15P基因的慢病毒载体，并对其在293T细胞内的表达进行研究。方法 PCR法扩增获得KSHV K15P基因，限制性内切酶Nhe I酶切和无缝克隆法构建重组慢病毒载体pCDH-CMV-K15P-GFP，通过脂质体转染试剂将重组慢病毒载体与3种辅助质粒pMDL-PRRE、pRSV-Rev和pMD2.g共转染HEK 293T细胞包装产生慢病毒，Western blot法检测K15P蛋白的表达。结果 经酶切及测序鉴定，成功构建慢病毒载体，重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染HEK 293T细胞可见有荧光表达，说明K15P基因在细胞内有表达并且96 h后产生4×106TU/ml滴度为慢病毒。结论 成功构建了KSHV K15P慢病毒表达载体pCDH-CMV-K15P-GFP，获得高效表达K15P基因的慢病毒颗粒，为后续其在细胞内的功能研究奠定实验基础。

卡波肉瘤相关疱疹病毒；K15P基因；慢病毒

卡波肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)，又被称为人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)，属于γ疱疹病毒亚科。华裔科学家Chang et al[1]于1994年在卡波肉瘤(Kaposi′s sacoma，KS)组织中发现该病毒，其除了是引起KS的病原体，还与多中心性Castleman病和原发渗液性淋巴瘤有关[2]。ORFK15位于KSHV整个基因组的最右端，处于第75个开放阅读框(ORF 75)和末端重复序列之间[3]。研究[4]表明K15P在KS的发生发展过程中起重要作用，尤其是肿瘤的血管新生。该实验通过构建K15P的慢病毒载体，获得高效表达K15P的慢病毒，旨在为研究K15P在细胞内的功能及KSHV的致病机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pFJ-K15P、pCDH-CMV-GFP、pMDL-PRRE、pRSV-Rev、pMD2.g 5种质粒和HEK293T细胞、宿主菌DH5α均由安徽医科大学微生物学实验室保存，其中pFJ-K15P重组质粒包含有K15P的全部8个外显子序列。其中HEK293T细胞培养于含有10%胎牛血清的高糖DMEM(美国Gibco公司)培养基中，培养基含有100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素。

1.2 主要试剂 限制性内切酶Nhe Ⅰ、PCR高保真酶和蛋白质预染Maker(美国Thermo公司);核酸提取试剂盒和凝胶纯化试剂盒( 北京天根生化有限公司);ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit(一步法无缝克隆试剂盒)(南京诺唯赞生物科技有限公司); Opti-MEM(美国Gibco公司);Lip2000(美国Invitrogen公司);兔抗GFP多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 pCDH-CMV-K15P-GFP重组质粒构建及鉴定

1.3.1 K15P基因的扩增 根据NCBI上K15P基因序列，引物设计合成由上海生工生物工程有限公司完成，上游引物：5′-AGATTCTAGAGCTAGCGAATGAAGACACTCATATTCTTCT-3′，下游引物： 5′-CCATAATTCGCTAGCTGTTCCTGGGAAATAAAACCT CC-3′； (下划线部分代表Nhe I的酶切位点)。以已有的pFJ-K15P质粒为模板，普通PCR进行基因扩增。PCR反应体系总共25 μl，包括pFJ-K15P质粒模板1 μl，10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各1 μl，高保真酶1 μl，ddH2O 17.5 μl。PCR反应体系：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，此过程共35个循环；之后72 ℃、10 min。产物经1%琼脂糖电泳，以DL 5 000 Maker 为参照，切胶回收目的条带并测定其浓度。

1.3.2 pCDH-CMV-K15P-GFP重组质粒的构建及鉴定 用Nhe Ⅰ单酶切pCDH-CMV-GFP质粒，于37 ℃ 酶切2 h，将其线性化，切胶回收，并测其浓度。按照ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit的说明书进行重组质粒构建。将构建好的重组质粒转化DH5α感受态细胞后均匀涂布于含有氨苄青霉素(Amp)的平板中，18～24 h后挑取阳性克隆，摇菌过夜并加入终浓度为30%甘油，冻存于-80 ℃冰箱。用试剂盒提取质粒，进行酶切初步鉴定，并送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.4 慢病毒的包装及滴度测定

1.4.1 慢病毒的包装 转染前将HEK 293T细胞调整浓度为1×106个/ml加入100 mm细胞培养皿中，待细胞融合度达到70%～80%时进行转染。慢病毒包装过程如下：1.5 ml离心管中加入500 μl Opti-MEM培养基，依次加入1.6 μg pCDH-CMV-GFP/pCDH-CMV-K15P-GFP、4 μg pMDL-PRRE、2 μg pRSV-Rev、2.4 μg pMD2.g，轻轻混匀，室温静置5 min。取另一支1.5 ml离心管加入500 μl Opti-MEM培养基，在其中加入36 μl Lip2000并轻轻混匀。然后混合上述两管溶液，轻轻混匀，室温静置30 min，形成质粒-Lip2000复合物。在静置期间，将培养皿中原培养液弃去，加入无双抗无血清的DMEM培养皿。30 min后将质粒-Lip2000复合物轻轻混匀后加入到细胞中，缓慢摇匀使复合物分布均匀。6 h后弃去培养基换成10 ml完全培养基。细胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h后收集上清液，4 ℃、3 000 r/min离心15 min去除细胞碎片，0.45 μm针式滤器过滤，然后60 000 r/min超速离心2 h收集沉淀，将病毒液分装，冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.4.2 慢病毒滴度测定 在96孔细胞培养板中每孔接种1×105个HEK 293T细胞，加入100 μl的DMEM完全培养基，37 ℃、5% CO2培养24 h后进行感染。取50 μl的病毒原液，用培养基按1×10-1～1×10-9比例进行梯度稀释，每个稀释梯度平行重复3孔，每孔加入5 μl病毒稀释液，感染24 h后，每孔换100 μl新鲜培养液，继续培养，以利于细胞的生长。感染96 h后，荧光显微镜下观察细胞荧光情况并找出有GFP荧光细胞(GFP+细胞)的病毒稀释梯度，同时记录下该梯度病毒稀释液感染的细胞中各孔中荧光细胞的数目，取平均值根据以下公式计算病毒滴度(BT=TU/ml)：病毒滴度(TU/ml)=(荧光细胞数/每孔加入病毒稀释液体积)×稀释倍数。

1.5 Western blot 法检测K15P蛋白的表达 将感染K15P重组慢病毒的细胞裂解、离心收集蛋白上清液并制样，经SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜后，5%脱脂牛奶封闭，以兔抗GFP多克隆抗体为一抗，4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜，加1 ∶5 000的HRP标记的山羊抗兔的二抗，室温孵育2 h，洗膜后曝光显影。

2 结果

2.1 重组慢病毒载体的构建和鉴定 以实验室保存的质粒pFJ-K15P为模板，PCR扩增K15P基因片段，在1 500 bp位置附近可见出现目的条带。见图1A。根据ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit说明书进行重组载体的构建。经Nhe I酶切后出现载体pCDH-CMV-GFP和K15P两条带，大小分别为6 947 bp和1 470 bp。见图1B。重组慢病毒质粒进行测序，并与GenBank中的K15P序列进行比对，结果正确，证明重组质粒连接成功。

图1 K15P基因PCR扩增及重组慢病毒载体的酶切鉴定

A：K15P基因PCR扩增图；B：重组慢病毒载体酶切鉴定图；C：重组质粒测序报告；M：DNA Marker;1：PCR对照组；2：PCR扩增产物约1 500 bp；:3：重组pCDH-CMV-K15P-GFP质粒；4：重组pCDH-CMV-K15P-GFP质粒Nhe Ⅰ酶切

2.2 慢病毒的包装及滴度测定 重组慢病毒载体与辅助包装质粒共转染到HEK 293T细胞中，96 h后荧光显微镜下观察到绿色荧光，表明质粒已成功转染到细胞内。收集对照组和慢病毒组的细胞上清液，分别测定对照组病毒滴度为1×107TU/ml，K15P慢病毒组病毒滴度为4×106TU/ml。见图2。

图2 慢病毒载体转染48 h后细胞状态及慢病毒阳性对照组和重组慢病毒组滴度测定 ×100

A：慢病毒载体和辅助质粒共转48 h；B：慢病毒阳性对照组病毒做10-7稀释后感染HEK 293T细胞72 h；C：重组慢病毒组病毒做10-7稀释后感染HEK 293T细胞72 h；1：荧光显微镜；2：光学显微镜

2.3 慢病毒感染HEK 293T细胞后K15P蛋白的检测 将相同体积的对照组和慢病毒组分别感染HEK 293T细胞，观察GFP的表达情况，提取总蛋白，Western blot法检测K15P蛋白的表达情况。见图3。

图3 Western blot 法检测HEK 293T细胞中K15P蛋白的表达

A：对照组病毒感染细胞所得样本；B：慢病毒组病毒感染细胞所得样本

3 讨论

KSHV又名卡波肉瘤相关疱疹病毒，为双链DNA病毒，属于γ疱疹病毒亚科[5]。KS是一种血管性恶性肿瘤， KSHV引起的相关肿瘤中KS发病率较高。研究[6]表明KS有4种不同的类型，地域型KS、经典型KS、移植型KS和AIDS相关型KS。KS好发于皮肤，也可累及黏膜和内脏器官，主要表现为全身或者局部出现内皮细胞来源的高度血管化的赘生物[7]。KS的发病率通常在非洲及部分欧洲地区及地中海国家比较高，尤其在非洲撒哈拉沙漠以南地区更为流行。但近些年来在美洲地区、台湾及韩国也出现卡波肉瘤病例[8-9]。我国KS的发病率较低，因此对KSHV的研究开展较晚，但近些年来，研究[10]显示我国新疆地区典型KS发病率较高，而在其他区域或民族人群发病较罕见。

K15基因位于KSHV基因组的最右端，由8个外显子构成，编码约45 ku，由12个跨膜结构域构成和1个位于细胞内的C端的膜蛋白[3]。K15基因至少存在3种等位基因，分别为P、M和N型，N型仅在非洲南部有发现，P和M型有33%的同源区域，而KS病例中主要是P型[11]。位于细胞质内的C端编码一个保守的SH 2结构域，能与酪氨酸激酶(Src)和肿瘤坏死因子相关受体因子(TRAF)结合，进一步激活JNK、ERK、MAPK等信号通路，发挥K15促进细胞增殖迁移和血管新生的作用[12-14]。

与传统的脂质体转染方法比较，慢病毒载体的操作更复杂，既要和辅助质粒共转染，还要经过病毒包装，产生具有感染能力的病毒颗粒以感染宿主细胞，但慢病毒能介导将目的基因整合到宿主基因组中，有助于获得目的基因长期稳定表达的细胞株，同时对于难以采用脂质体转染或者转染效率不高的细胞，脂质体转染就存在弊端，而从理论上说病毒能够感染所有细胞，因而慢病毒较脂质体更具优势[15]。

本实验通过成功构建慢病毒载体，包装、浓缩产生高效表达K15P基因的慢病毒颗粒，感染HEK 293T细胞，Western blot法检测到293T细胞内表达的K15P蛋白。本实验结果为研究K15P基因在内皮细胞内的功能和KSHV的致病机制奠定了实验基础。

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Construction and the titer determination of lentivirus vector containing KSHV K15P gene

Xu Changqing1,2, Chen Wei1, Fang Yuan1, et al

(1DeptofMicrobiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032;2DeptofClinicalLaboratory,TheThirdPeople’sHospitalofHefei,Hefei230000)

ObjectiveToconstructthelentivirusvectorcontainingKaposisarcoma-associatedherpesvirus(KSHV)ORFK15Pandstudyitsexpressionandfunctionsin293Tcells.MethodsThegeneregionofK15P,whichwasamplifiedbyordinaryPCR,wasclonedintopCDH-CMV-GFPvectorwithNheIrestrictionenzyme.TherecombinantplasmidwasthentransientlytansfectedintoHEK293Tcell.ThepCDH-CMV-K15P-GFPplasmidwasco-transfectedwiththreeassistedplasmidsofpMDL-PRRE,pRSV-Rev,pMD2.gintoHEK293Tcelltoproducelentivirusparticlesafter96handWesternblotwasperformedtodetecttheexpressionofK15Pprotein.ResultsThelentivirusvectorwassuccessfullyconstructedandthetiteroflentiviruswas2×106transducingunits/mlatthetimeof96hoursafterco-transfected.ConclusionK15Pexpressionlentiviralvectorissuccessfullyconstructed.ItbuiltsanexperimentalbasisfortheK15Pfunctionalstudyin293Tcells.

Kaposisarcoma-associatedherpesvirus;K15Pgene;lentivirus

时间：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.005.html

2016-06-02接收

国家自然科学基金 (编号：81271837)；安徽省高校省级科学研究项目(编号：KJ2012A161)；安徽医科大学博士科研经费资助项目(编号：XJ200914)

1安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032

2合肥市第三人民医院检验科，合肥 230000

许常青，男，硕士研究生；

王林定，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail: wanglinding@ahmu.edu.cn

R 394.3；R 373.9

A

1000-1492(2016)10-1417-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.005