川芎嗪对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力和细胞周期蛋白E、P21表达的影响

尹淑杰 张 涛 荣光影 宋庆娇 汪 悦 柳朝阳

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)



川芎嗪对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力和细胞周期蛋白E、P21表达的影响

尹淑杰1张 涛 荣光影 宋庆娇 汪 悦 柳朝阳2

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

目的 探讨川芎嗪(TMP)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆和细胞周期蛋白(Cyclin)E、P21表达的影响及作用机制。方法 大鼠海马区注入β淀粉样蛋白(Aβ)1～42制作AD模型。Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力；免疫组化法检测海马区CyclinE和P21蛋白的表达。结果 低、高剂量TMP组均能改善 AD大鼠的学习记忆能力(P<0.01，P<0.05),下调大鼠海马CyclinE蛋白表达(P<0.05),上调P21蛋白表达(P<0.05)。低、高剂量TMP组相比无明显差异。结论 TMP能改善AD大鼠学习记忆功能,下调CyclinE蛋白和上调P21蛋白表达，减轻神经细胞凋亡。

川芎嗪；阿尔茨海默病；细胞凋亡

阿尔茨海默病(AD)的病理特征为神经元纤维缠结、老年斑和神经元广泛丢失等〔1〕。有研究表明〔2〕细胞凋亡是引起大量神经元丢失的主要原因之一，细胞凋亡可通过细胞周期蛋白的异常表达介导〔3〕。故通过调节细胞周期相关蛋白的表达可以减少神经细胞凋亡，延缓AD发病。本实验采用β-淀粉样蛋白(Aβ)1～42海马区注入制作 AD 模型，观察川芎嗪(TMP)对AD大鼠学习记忆能力及海马区细胞周期蛋白E(CyclinE)和P21蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 采用10～14月龄SD大鼠，体重 210～230 g，佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂 磷酸川芎嗪片(北京市燕京制药厂,50 mg/片,批号030201)；Aβ1～42(Sigma公司)；兔抗大鼠CyclinE多克隆抗体，兔抗大鼠P21多克隆抗体，免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 AD模型建立〔4〕和动物分组 大鼠麻醉后，固定在颅脑立体定位仪，暴露前囟，按大鼠脑立体定位图谱进行定位，在前囟后方 3.3 mm、中线左右各旁开1.9 mm穿颅钻一小孔(直径约1 mm)，将微量注射器垂直插入，缓慢进针2.4 mm 至海马，分别注入Aβ1～425 μl，注射后留针 5 min，缓慢拔针。术后牙托粉封固颅骨孔,青霉素预防感染。

将40只SD大鼠随机分为五组(每组8只)：正常对照组、假手术组、AD模型组、TMP低剂量组(150 mg·kg-1·d-1)(L-TMP组)、TMP高剂量组(250 mg·kg-1·d-1)(H-TMP组)。

1.3.2 Morris水迷宫实验〔5〕造模后第7天起进行水迷宫实验，连续5 d，前4 d作逃避潜伏期实验。在水迷宫中央隐蔽平台的位置，将大鼠头朝外壁在任何一个象限内的随机位置放入水中，潜伏期是指大鼠在120 s内从入水点爬到平台所需时间。实验中，如果在120 s内大鼠找到平台，让大鼠站立在平台上10 s；如果找不到，引导大鼠爬上平台，并站立10 s，潜伏期计为120 s。空间探索实验在第5天进行，平台撤掉，从第二象限任何点放大鼠入水，记录大鼠在120 s内的游泳路径,计算大鼠在入水象限游泳路径长度占总路径长度的百分比。Morris水迷宫图像处理系统完成数据采集和处理。

1.3.3 免疫组化法检测大鼠海马CyclinE和P21蛋白的表达 取大鼠海马组织于4%多聚甲醛中固定24 h,进行乙醇系列脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋,制成4 μm厚连续切片。切片常规脱蜡至水,高压修复抗原,冷却后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,滴加适当稀释的一抗,37℃恒温水浴箱孵育2 h,滴加二抗,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。经DAB显色,CyclinE和P21阳性细胞为黄褐色。 用PBS代替一抗作为阴性对照。 在CyclinE和P21免疫组化染色切片的海马区各取3个视野(×400),应用图像分析系统测量每个视野内CyclinE和P21阳性细胞数。

1.4 统计学方法 应用SPSS11.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 Morris 水迷宫实验结果 与正常对照组相比，在前4 d逃避潜伏期实验中，AD模型组潜伏期明显延长(P<0.01)；与正常对照组相比，在第5天空间探索实验中，AD模型组穿越平台象限路径占总路径百分比降低(P<0.05)。与AD模型组相比，低、高剂量TMP组逃避潜伏期和穿越平台象限路径百分比明显改善(P<0.01，P<0.05)。高剂量TMP组较低剂量TMP组有所改善，但无统计学意义。正常对照组和假手术组逃避潜伏期和穿越平台象限路径比无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠水迷宫实验结果

与正常对照组相比：1)P<0.01，2)P<0.05；与AD模型组相比:3)P<0.01，4)P<0.05

2.2 免疫组化检测CyclinE和P21蛋白表达结果 与正常对照组相比，假手术组CyclinE和P21表达阳性细胞数无显著差异(P>0.05)，而AD模型组大鼠海马组织CyclinE阳性细胞数明显增加(P<0.05)，P21阳性细胞数明显减少(P<0.01)；与AD模型组相比,TMP各组CyclinE阳性细胞数明显减少(P<0.05)，P21阳性细胞数明显增加(P<0.05)；低、高剂量TMP组相比，CyclinE和P21阳性细胞数均无显著性差异(P>0.05)。提示TMP能减少CyclinE的表达和增加P21的表达。见表 2。

表2 各组大鼠海马CyclinE和P21表达阳性细胞数

与正常对照组相比：1)P<0.01，2)P<0.05；与AD模型组相比:3)P<0.05

3 讨 论

本实验中AD大鼠学习能力和记忆保持能力明显降低，TMP治疗后AD大鼠的学习能力和记忆保持能力得以明显改善。细胞凋亡是引起AD病理特征之一的神经元丧失的主要机制〔6〕。Cyclin、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)相互作用调控细胞周期，使细胞分裂正常进行。如果Cyclin、CDK或CKI三者的平衡被打破，细胞周期将重启进入有丝分裂，后期出现障碍，细胞分裂失败，细胞周期停滞，形成细胞凋亡〔7〕。

AD病人正常的脑神经细胞已停止分化处于G0期。Vincent等〔8〕发现，AD患者脑中有神经元重新进入细胞周期，由于CKI失活，导致神经细胞经过G1/S期检验点，DNA复制后进入G2期，但是细胞不能进行正常的分裂，凋亡程序启动，细胞凋亡引发〔3〕。

CyclinE与CDK2结合在 G1/S 期启动和运行中发挥作用。CyclinE可激活视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)，使其与转录因子(E2F)解离，E2Fs可促进形成CyclinE-CDK2复合体，使细胞越过G1/S期检验点，进入S期，CyclinE-CDK2复合体进一步磷酸化pRb，使E2F充分释放，促进有关S期DNA复制的基因表达〔9〕。

P21属于CKI家族成员，可结合并抑制CyclinE-CDK2等复合物的磷酸化活性，使Rb低磷酸化不能解离E2F而致DNA合成障碍，使细胞停滞在G1期。另外，P21分子可与增殖细胞核抗原(PCNA)结合，使PCNA不能与DNA聚合酶形成δ复合物，影响DNA的复制〔10〕，从而阻止细胞重新进入分裂周期失败而导致细胞凋亡。

CyclinE在G1期表达，CyclinE-CDK2复合体正性调控细胞周期，而P21负性调控细胞周期，CyclinE与P21表达紊乱可引发细胞周期紊乱。

本文结果显示，大鼠海马区注入Aβ1～42后，可上调CyclinE表达，启动了神经元的细胞周期；同时由于其神经毒性，使P21的表达抑制，打破细胞周期的平衡状态，引发细胞凋亡。TMP可通过下调CyclinE蛋白表达和上调P21蛋白表达阻止细胞重新进入细胞周期，减少神经细胞凋亡，从而延缓AD大鼠脑神经病理进程，减少Aβ对脑细胞神经元的损伤，进而改善大鼠学习记忆能力。

1 Petrella JR,Coleman RE,Doraiswamy PM.Neuroimaging and early diagnosis of Alzheimer's disease:a look to the future〔J〕.Radiology，2003;226(2):315-36.

2 黄文林，朱孝峰.信号转导〔M〕.北京:人民卫生出版社，2007:345-7.

3 McPhie DL，Coopersmith R，Hines-Peralta A，etaI.DNA synthesis and neuronal apoptosis caused by familial Alzheimer's disease mutants of the amyloid precursor protein are mediated by the p21 activated kinase PAK3 〔J〕.J Neurosci，2003;23(17)：6914-27.

4 朱飞奇，马 英，钱采韵.大鼠海马立体定向注射Aβ 1-40建立阿尔茨海默病动物模型〔J〕.郧阳医学院学报,2008;27(2):106-8.

5 刘洁生，陈 式，谢丽玲，彭志英.K-银环蛇毒素对小鼠被动学习和空间记忆的影响〔J〕.卫生研究,1998;27(S1):96-9.

6 庄 莹，陈 杰.阿尔茨海默病病因及发病机制研究进展〔J〕.吉林医药学院学报，2008;29(2)：101-4.

7 谢朝阳，祝其锋.细胞周期调控与阿尔茨海默病的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2004;24(4)：379-81.

8 Vincent I,Rosado M,Davies P.Mitotic mechanisms in Alzheimer's disease〔J〕?J Cell Biol,1996;132(3):413-25.

9 Obaya AJ,Sedivy JM.Regulation of cyclin-Cdk activity in mammalian cells〔J〕.Cell Mol Life Sci,2002;59(1):126-42.

10 马 骥，刘文超.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂与肿瘤相关性的研究进展〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，2009;16(3)：315-8.

〔2015-11-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

黑龙江省自然科学基金资助项目(H2015074)；黑龙江省大学生创新创业训练项目(20050222026)；黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目(1252G059)；佳木斯大学科技重点项目(Sz2011-009)

柳朝阳(1971-)，男，硕士，副主任医师，主要从事神经干细胞和阿尔茨海默病机制研究。

尹淑杰(1969-)，女，副主任医师，主要从事脑血管病、癫痫，头痛及眩晕的诊断和治疗研究。

R749.16

A

1005-9202(2016)20-4961-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.009

1 济宁市第二人民医院神经内科

2 佳木斯大学附属第一医院