Wistar大鼠福氏佐剂性类风湿关节炎动物模型研究

朱玉芳 裴银辉 周芳媛 熊艳杰 董素宁 赵一帆 郑亚楠

华北理工大学 河北唐山 063000



Wistar大鼠福氏佐剂性类风湿关节炎动物模型研究

朱玉芳 裴银辉 周芳媛 熊艳杰 董素宁 赵一帆 郑亚楠

华北理工大学 河北唐山 063000

①目的 探讨Wistar大鼠佐剂性类风湿关节炎造模效果，为类风湿关节炎发生机制及治疗效果等相关研究中动物模型的应用提供实验依据。②方法 将大鼠随机分为两组，分别为模型组和正常对照组，每组各20只。模型组于大鼠右足趾皮下注射福氏完全佐剂(CFA)0.15mL，造模后第7、14、21、28天对两组大鼠进行关节炎评分。测量每组大鼠右足趾关节肿胀度，分离脾脏并制备脾细胞悬液，计算脾细胞增殖率，ELISA法检测血清中IL-10与IL-17的含量。③结果 模型组致炎后7天足趾肿胀达峰值，14天后再度肿胀，21天出现皮肤溃疡，28天后溃疡面进一步扩大。大鼠模型组第14天脾细胞增殖率高于第7天和第21天，差异有统计学意义(P<0.05)，模型组不同时期脾细胞增殖率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组第7、28天关节炎评分高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；第7、14、28天血清中IL-10与IL-17的含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。④结论 模型组关节肿胀明显，大鼠表现接近于人体的类风湿关节炎(RA)，且造模过程简单、稳定，是研究RA的较理想模型。

类风湿关节炎 Wistar大鼠 动物模型 福氏完全佐剂

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，表现为对称小关节的慢性关节滑膜炎症，而且以炎症的持续反复发作为主要特征[1]。其病程主要表现为关节滑膜增生和血管翳形成，继而造成关节软骨的破坏，最终导致骨、关节坏死从而致残。我国RA的患病率为0.32%～0.36%，略低于0.5%～1%的世界平均水平[2,3]，是造成人类劳动力丧失和致残的主要因素之一。该疾病确切病因及发病机制尚未完全明确，目前尚无有效的治疗方法。由于RA是由环境、免疫、遗传、感染等多种复杂因素共同作用的结果，而目前的RA动物模型只是在特定条件下，选取其中某一个或某几个侧重因素而建立起来，并不能完全反映RA的所有属性，不同的RA动物模型可能只代表RA发病特点的某一个或某几个方面。其次，RA患者临床表现的局部疼痛、全身发热、活动情况、饮食改变等都能通过患者的主诉反映出来，但RA动物模型的所有这些指标却无法客观反映出来。因此，建立与人类临床及病理表现相似的动物模型，可为探讨RA的病因、发生机制、病理进程，进一步寻找有效的治疗手段奠定基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料 5周龄雌性Wistar大鼠40只，体质量为(175.3±15.8)克。购自华北理工大学实验动物中心(动物合格证号SCXK(军)2014-0001)，适应性喂养1周(动物房许可证号SYXK(冀)2015-0038)。随机分为两组，佐剂型关节炎模型组和正常对照组，每组20只。造模后所有动物均在同等条件下喂养，自由饮水进食，普通饲料定时、定量喂养，选择光线充足，通风良好的实验环境下饲养。

1.2 仪器与试剂 卡介苗购自上海瑞楚生物科技有限公司；羊毛脂购自中国嘉定华亭羊毛脂厂；液体石蜡购自天津市大茂化学试剂厂；75%酒精；白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒，96人份购自联科生物技术有限公司(批号231041231)；白细胞介素-17(IL-17)ELISA试剂盒，96人份购自美国eBioscience公司(批号109559013)；促凝管(生化用)购自上海科华检验医学产品有限公司；SL-N电子天平购自上海民桥精密科学仪器有限公司；游标卡尺购自深圳市新德亚精密仪器有限公司；酶标仪购自美国伯乐Bio-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)模型制备。福氏完全佐剂(complete frennd's adjuvant,CFA)的配制：取羊毛脂16克与液体石蜡(72mL)加温后置于研钵中，然后将卡介苗62毫克滴加入研钵(逐滴加入)，充分研磨均匀后分装至1.5mLEP管中，置8磅高压20分钟。

模型组大鼠用75%酒精对大鼠右足趾进行消毒，将CFA 0.15mL注射于大鼠右足趾皮下，对照组不经任何处理。在实验后的第7、14、21、28天分四批次处死动物，每次每组随机取5只。观察记录不同发病阶段大鼠一般状况，包括毛发整齐、光泽度、体质量、行动迟缓度、精神状态等；观察耳、尾、足是否出现关节红肿及其他炎症反应。对两组大鼠进行关节炎评分，测量每组大鼠右足趾关节肿胀度；分离脾脏并制备脾细胞悬液，计算脾细胞增殖率； ELISA法检测血清中IL-10与IL-17的含量。

1.3.2 关节炎评分。根据关节炎发病大鼠的关节红肿程度和范围以及关节肿胀变形情况，按0～4级进行评分如下:0分，正常;1分，踝关节有红斑及轻微肿胀;2分，踝关节至趾关节或掌关节有红斑及轻微肿胀；3分，踝关节至掌关节或趾关节有红斑及中度肿胀；4分，踝关节至趾关节有红斑及重度肿胀。每只足趾单独评分，将四肢评分相加作为关节炎评分，每只大鼠最高16分。

1.3.3 ELISA方法检测大鼠血清中IL-10、IL-17水平。心脏采血2mL,3000r/min离心15分钟，留取血清于-20℃保存，应用ELISA法检测大鼠RA模型血清中IL-10、IL-17的含量。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 脾细胞增殖率。手术摘取大鼠脾脏，将大鼠脾脏放入平皿中置于细胞筛上，倒入生理盐水研磨，取悬液滴在玻片上，待玻片干燥后进行瑞氏染色，计数100个细胞中阳性的个数。阳性细胞表现为体积增大、胞浆有空泡或细胞可见核仁。

1.4 统计学处理 应用SPSS 11.5 软件进行统计学分析。组内均数比较采用方差分析，组间比较采用t检验。检验水准取双侧α=0.05。

2 结果

2.1 模型组造模后表现 模型组动物造模后食量减退，行动迟缓，精神不振，皮毛失去光泽，体质量轻微下降。致炎后7天左右右足趾肿胀达峰值，持续3天后逐渐减轻；14天后再度肿胀，表现为对侧和前足肿胀，且呈进行性加重，行动不便；于21天左右出现皮肤溃疡，28天后溃疡面进一步扩大。

2.2 模型组不同时期各指标结果比较 经方差分析，模型组脾细胞增殖率在各阶段差异均有统计学意义(P<0.05)；右足趾关节肿胀度、关节炎评分、血清中IL-10和IL-17浓度在各阶段差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。进一步对脾细胞增殖率在组内各阶段的差异进行两两比较，第14天大鼠脾细胞增殖率高于第7天和第21天，且其与第7天、第21天比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 模型组不同时期大鼠各指标结果比较

2.3 模型组与对照组不同时期各指标结果比较 经t检验，大鼠第14、21天右足趾关节肿胀度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；第7、14、21、28天关节炎评分和脾细胞增殖率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；第7、14、28天血清中IL-10与IL-17的含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2～6。

表2 两组大鼠不同时期右足趾关节肿胀度(mm)结果比较

表3 两组大鼠不同时期关节炎评分结果比较

表4 两组大鼠不同时期脾细胞增殖率(%)结果比较

表5 两组大鼠不同时期血清IL-10浓度结果比较

表6 两组大鼠不同时期血清IL-17浓度结果比较

3 讨论

RA是一种自身免疫性疾病，成功的动物模型是研究RA发生机制及防治的基础。目前RA动物模型根据构建方法大体可分为两大类，即诱导性关节炎模型和自发性关节炎模型。用于实验的主要是诱导性关节炎模型，包括佐剂性关节炎模型、胶原诱导性关节炎模型、卵蛋白诱导的关节炎模型、病证结合模型等。这些动物模型虽然均有关节炎表现，但迄今尚没有任何一种动物模型能完全模拟人类RA的病理、病程及免疫学变化。 本研究采用雌性Wistar大鼠，通过注射福氏完全佐剂造模[4～7]，观察完全佐剂型造模效果。结果表明：模型发病机制主要表现为早期致炎部位的炎症反应，致炎后7天，IL-10和IL-17升高，右足趾关节肿胀度开始增高，关节炎评分开始增高，且呈进行性加重，行动不便；第14天左右右足趾关节肿胀度达到峰值，持续7天再度肿胀，IL-10和IL-17第14天左右达峰值后开始降低，持续7天再度升高，于28天左右达峰值。实验结果表明大鼠不同时期脾细胞增殖率高于对照组，免疫学改变为IL-10和IL-17升高。这些表现接近人类RA。AA大鼠与RA患者在关节肿胀方面具有某些相似性，但AA大鼠存在明显的细胞免疫异常，表现出较为明显的免疫功能紊乱现象，而RA患者多同时表现出体液和细胞免疫功能的异常，这可能是AA大鼠免疫功能紊乱与RA患者的不同之处。

本研究造模方法简单易操作，造模效果稳定，且临床病理与病程表现及免疫学改变类似于人类RA，是比较理想的类风湿关节炎动物模型。这能为类风湿关节炎发生机制及治疗效果评价等相关研究中动物模型的应用提供实验依据。

[1] 肖楚吟,潘云峰,吴玉琼,等.类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞体外增殖活性的研究[J].中华关节外科杂志,2010,4(5):631-636

[2] 陆再英,钟南山.内科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社,2008.848

[3] 薛盟举.类风湿关节炎的中医实验动物模型及评价[J].中医杂志,2012,53(17):1512-1515

[4] Greish S,Abogresha N,Abdel-Hady Z,et al.Human umbilical cord mesenchymal stem cells as treatment of adjuvant rheumatoid arthritis in a rat model[J].World Journal of Stem Cells,2012,4(10):101-109

[5] 彭传玉,罗 磊,胡 玲,等.不同剂量弗氏完全佐剂对类风湿关节炎模型大鼠复制的影响[J].中国医药指南,2012,10(1):1-3

[6] 李艳玲,祁 芳,许 明,等.常用类风湿关节炎动物模型研究概况及展望[J].湖南中医药大学学报,2015,35(4):63-66

[7] 佟 丽,辛增辉,陈育尧,等.Mtb诱导的SD大鼠佐剂性关节炎模型的建立及评价[J].中国药理学通报,2009,25(2):259-263

(2016-04-26 收稿)(库雪飞 编辑)

Study on animal model of rheumatoid arthritis with frennd's complete adjuvant in Wistar rats

ZHUYufang,PEIYinhui,ZHOUFangyuan,etal

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To explore the effect of adjuvant rheumatoid arthritis model in Wistar rats,and provide experimental evidence for the application of animal models in the study of the mechanism of rheumatoid arthritis and the evaluation of therapeutic effect.Methods The rats were randomly divided into two groups,model group and normal control group,20 in each group.Rats in model group were injected with CFA 0.15mL.Then respectively to arthritis score of each group rats,measure the joint swelling of rats in each group,and calculate the spleen cell proliferation rate at the 7,14,21 and 28 days.Meanwhile heart blood and serum was separated to detect the content of serum IL-10 and IL-17 with ELISA method.Results Rats in model group induced inflammation after about 7 days the right toe swelling reached the peak.Then the right toe swelling agained about 14 days.The skin ulcer in rats occurred around 21 days.At 28 days,further pathological changed and ulcer surface to further expanded.In model group,The 14 days rats’ spleen cell proliferation rate was higher than 7 days and 21 days,and the difference was significant (P<0.05).The rats’ spleen cell proliferation rate in model group was higher than that in control group at different times,and the difference was significant (P<0.05).The rats’ arthritis score in model group at 7 days and 28 days was higher than the control group,and the difference was significant (P<0.05).The content of serum IL-10 and IL-17 at 7,14 and 28 days were higher than the control group,the difference was significant (P<0.05).

Rheumatoid arthritis.Wistar rats.Animal model.Frennd's complete adjuvant

朱玉芳(1987-)，女，硕士研究生。研究方向：医学检验。

裴银辉。

R 392.9

A

2095-2694(2016)05-337-04

Conclusion The rats’ joint swelling of model group is obvious,and the performance of rats is closer to human RA.Then the modeling process is simple and stable, which is an ideal animal model of rheumatoid arthritis.