电针对兔易损粥样斑块内PDGF-BB及其受体PDGF-AB影响的研究>*

张洪侠，姜希娟，郭茂娟，张 敏

(1.天津中医药大学，天津 300193；2.泰安市妇幼保健院，山东 泰安 271000)



电针对兔易损粥样斑块内PDGF-BB及其受体PDGF-AB影响的研究>*

张洪侠1，姜希娟1，郭茂娟1，张 敏2△

(1.天津中医药大学，天津 300193；2.泰安市妇幼保健院，山东 泰安 271000)

目的：观察电针对动脉粥样硬化易损斑块内血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)及其受体PDGFR-AB的影响，探讨电针稳定斑块的机制。方法：随机将24只实验兔分为两组：假手组(8只)、实验组(16只)。造模方法采用腹主动脉内皮球囊拉伤配合高脂饮食以及蝰蛇毒和组胺药物触发的方法建立兔腹主动脉不稳定斑块模型，8周末再次将实验组随机分为模型组和电针组，历经12周。采用HE染色观察斑块病理形态学及新生血管的结构情况；采用免疫组学法检测腹主动脉斑块内内皮细胞标志物第八因子相关抗原(FⅧRag)的变化；采用Western blot技术检测PDGF-BB及其受体PDGFR-AB变化。结果：实验结果显示模型组多数以易损斑块为主，斑块内新生血管以单层内皮细胞为主，而电针组干预后斑块相对稳定，新生血管周围的周细胞增多；Western blot检测结果，电针可提高斑块内PDGF-BB、PDGFR-AB蛋白表达水平，与模型组相比差异有显著性。结论：电针具有稳定易损斑块的作用，其机制可能与上调斑块内PDGF-BB、PDGFR-AB表达、募集更多周细胞有关。

电针;易损斑块;血管新生;血小板源性生长因子

易损斑块的不稳定以致破裂将导致急性心脑血管病的发生甚至危及生命，因此，稳定斑块是当前亟待解决的问题。斑块内新生血管不成熟是导致斑块不稳定的重要原因，重塑斑块内新生血管为稳定斑块提供了新思路。易损斑块内新生血管往往缺乏周细胞的包绕，管壁通透性升高乃致炎细胞入侵；血管脆性增加乃致血管破裂，进而导致斑块不稳定[1]。因此，实现内皮细胞对周细胞的募集是新生血管得以成熟的重要环节。研究发现， PDGF/PDGFR是内皮细胞募集周细胞的重要通路[2-3]。

电针能够有效稳定斑块[4]。文献检索发现，电针对生长因子PDGF-BB及其受体的表达具有调节作用[5]。因此，提出假设：电针是否是通过提高PDGF-BB、PDGFR-AB表达，提高周细胞募集，达到稳定血管的作用。本课题以家兔不稳定斑块动物模型为研究对象，以周细胞的募集为出发点，观察电针对PDGF-BB/PDGFR-AB通路的影响，探讨电针促新生血管成熟的机制，为临床稳定斑块提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

蝰蛇毒(广州蛇毒研究所)；组胺；PDGF-BB的ELISA试剂盒(美国 R&D)；球囊扩张压力泵(美国Cordis公司)；球囊(天津市中拓乳胶厂) ；电针治疗仪为G6805-2(鑫升牌G6805-2)；胆固醇粉(天津市英博生化试剂有限公司)。

1.2 动物模型的制备及干预

动物分组及饮食：选取健康雄性日本大耳白兔24只，体质量(2.0±0.3)kg，由北京科宇动物饲养中心提供。随机进行分组：假手术组8只、实验组16只。实验组选用腹主动脉内皮球囊拉伤配合高脂饮食以及蝰蛇毒和组胺药物触发的方法建立兔腹主动脉不稳定斑块模型[6]。第8周末对实验组兔再次随机分组：模型组(8只)和电针组(8只)，并且3组实验动物均改为普通饮食。高脂饲料配方：胆固醇2%、大豆色拉油10%、普通饲料88%。

模型的制备及药物激发：将兔固定后进行麻醉，选择兔子右下肢进行右股动脉剥离术。靠近远心端做动脉切口，并导入预先套好橡胶帽的4F导管，连接压力注射泵，推注空气，然后抽拉，重复3次，然后结扎、缝合及局部消毒完成对内皮的拉伤术。动物处死前24h和48h分别给予蝰蛇毒、组胺两次激发。蝰蛇毒选择腹膜下注射, 组胺经耳缘静脉注射。

电针干预：实验动物于第8周末开始电针干预，参照郭义主编的《实验针灸学》[7]教材，选取足三里和内关穴，采用G6805-2型多通道电针仪。选择疏密波，频率16～18次/min，以兔四肢微微抽动为宜的强度，20min/次/日，持续4周。

取材：实验末进行腹主动脉的取材，把取出约10cm腹主动脉进行分段，下端约4cm进入福尔马林固定进行HE染色；上端约6cm进行蛋白印迹实验使用。

1.3 指标观察及检测方法

取出的一段腹主动脉经固定、包埋、切片后作苏木精-尹红(HE)染色，观察斑块组织形态学及斑块内新生血管的变化。应用western blot检测腹主动脉斑块中PDGF-BB和PDGFR-AB的蛋白水平的变化。称取血管组织，剪碎后冰上研磨，加入裂解液M-PerTM，裂解后离心，收集上清液，应用Bradford法测定蛋白含量。采用硫酸镍铵增强的DAB显色法显色；凝胶成像系统上扫描分析，蛋白含量以条带的A值×面积(Int×mm2)表示，实验重复2次。

1.4 统计处理

2 结果

2.1 组织形态学结果

光镜下可见模型组内皮细胞脱落，内中膜明显增厚，向管腔内凸起，可见巨噬细胞及各种来源的泡沫细胞及脂质沉积于内膜下；斑块内新生血管多由单个内皮细胞围成，周围缺乏周细胞包绕。电针组内膜增厚降低、纤维帽增厚，斑块内脂质含量及炎性细胞含量减少，新生血管周围的壁细胞明显增多。提示电针有改善新生血管结构、促进新生血管成熟、稳定易损斑块的作用。见封三彩图1。

2.2 斑块内新生血管变化

FⅧRag是新生血管内皮的特异性标志物。本实验结果显示，假手术组腹主动脉内膜相对光滑，无斑块形成，故阳性面积无法统计。模型组斑块内新生血管周围可见更多棕黄色颗粒FⅧRag的表达。电针组分布与模型组一致，但与模型组相比，显著减少(P<0.05)。见图2及表1。

表1 FⅧRag免疫组化染色结果比较

2.3 斑块内PDGF-BB和PDGFR-AB表达

内皮细胞对周细胞的募集依赖PDGF-BB/PDGFR-AB通路的调节。本研究结果表明，电针组PDGF-BB、PDGFR-AB表达高于模型组，相比具有差异(P<0.05)，提示电针可有效稳定斑块，抑制斑块内血肿形成,重塑新生血管结构，上调周细胞PDGF-AB受体的表达。见图3和表2。

表2 各组PFGF、PFGFR灰度值比较

图3 各组PDGF-BB、PDGFR-AB表达情况

3 讨论

电针抑制斑块破裂与促进斑块内新生血管成熟有关。基底膜的形成作为新生血管成熟的标志，表现为周细胞对内皮细胞的募集，形成有周细胞包绕的稳定的血管。研究显示，PDGF-BB及受体在调控周细胞的募集中扮演重要的作用[8]。

PDGF是一种二硫化合物二聚体，由α链和β链构成，PDGF家族成员中尤其PDGF-BB是重要的促血管成熟生长因子， PDGF-BB通过与周细胞表面的受体PDGFR-AB结合，募集周细胞包绕新生血管周围形成完整的血管结构，起到稳定内新生血管的作用[9]。PDGF-BB表达减少将会导致周细胞密度的显著下降。研究发现[10]，研究应用PDGF和PDGFR基因敲除后的小鼠作为研究对象，结果发现新生血管周围缺乏周细胞，血管脆性大，易出现出血现象，表明PDGF是血管成熟的重要因子。本研究发现，实验组斑块内均有新生血管的出现，电针组新生血管数量相对较少，相对成熟，并且斑块破裂少于模型组。本研究采用蛋白免疫印迹法评价斑块内PDGF-BB、PDGFR的表达情况。结果发现，与模型组相比，电针组斑块内PDGF-BB、PDGFR的表达明显增加。提示电针可能通过激活PDGF-BB、PDGFR信号调节传导通路，达到募集周细胞,促新生血管成熟，进而稳定斑块的作用，这可能是电针稳定斑块的机制之一。

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[4] 万征，王蕾，周海纯.项部针刺对动脉粥样硬化兔斑块内新生血管影响的实验研究[J].针灸临床杂志，2015,31(9):73-76

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国家自然基金项目,编号：81102699,81173413。

张洪侠(1978-)，女，实验师，研究方向:心脑血管疾病的基础研究。

△通讯作者：张敏(1973-)，女，主治医师，研究方向：心脑血管疾病防治及临床研究。

R246.6

A

1005-0779(2016)10-0087-03

2016-05-15