芥菜型油菜脂肪酸含量的变异、相关性分析及芥酸调控基因FAE1特异引物设计

田恩堂, 李鲁峰, 贾世燕, 林树春

( 1. 贵州大学 油料作物研究所， 贵阳 550025； 2. 杭州市萧山区农业科学技术研究所，杭州 311200； 3. 杭州市萧山区种子管理站， 杭州 311200 )

芥菜型油菜脂肪酸含量的变异、相关性分析及芥酸调控基因FAE1特异引物设计

田恩堂1*, 李鲁峰2, 贾世燕3, 林树春1

( 1. 贵州大学 油料作物研究所， 贵阳 550025； 2. 杭州市萧山区农业科学技术研究所，杭州 311200； 3. 杭州市萧山区种子管理站， 杭州 311200 )

芥菜型油菜是我国芸苔属的三大油料作物之一，具有耐旱、抗病虫等优良特性；而我国是芥菜型油菜的重要起源中心，具有丰富的种质资源。该研究从全国各地搜集了34份芥菜型油菜，在贵阳环境条件下种植，其脂肪酸含量(芥酸、油酸、硬脂酸、亚麻酸和亚油酸)表现出丰富的变异，并呈正态分布。结果表明：这些芥菜型油菜种质资源的不同脂肪酸含量间的相关性发现，芥酸和油酸间呈极显著负相关，亚麻酸和硬脂酸呈极显著的正相关，亚麻酸和亚油酸呈现负相关。利用这些材料的脂肪酸含量进行主成分分析，发现绝大部分材料(30份，占88.2%)集中在二维图的特定区域，只有少数其它材料散落在图中其它区域，他们分别是SL63、棱角油菜、T6342和长阳黄芥，这些变异较大的材料在芥菜型油菜的育种中可以发挥特殊作用。此外，运用来自甘蓝型油菜和甘蓝的芥酸调控基因FAE1的已知序列，并设计了FAE1特异引物，而引物在全部34份芥菜型油菜种质资源中均表现出了较好的扩增效果。因此证实芥菜型油菜中至少含有一个FAE1拷贝。该研究结果对于芥菜型油菜育种在我国的开展及其未来的分子育种具有重要的指导意义。

芥菜型油菜， 脂肪酸， 引物设计，FAE1， 基因扩增

甘蓝型油菜(Brassicanapus, AACC, 2n=38)、芥菜型油菜(B.juncea, AABB, 2n=36)和白菜型油菜(B.rapa, AA, 2n=20)是我国芸苔属的三大油料作物(何余堂等，2002)。耐旱、耐贫瘠、黄籽、抗病虫、可做调料和蔬菜等独特品性是芥菜型油菜的重要特征。我国是芥菜型油菜的重要起源中心，具有丰富的种质资源。加强芥菜型油菜的理论和应用研究有利于抗性基因资源在甘蓝型油菜和白菜型油菜中的应用，及促进山地农业的发展和保障我国油料安全。芥菜型油菜在我国西南地区广泛种植，如贵州、四川、云南，因部分基因型表现出独特的口味，可以作为蔬菜食用，也可作为调料用芥末。脂肪酸是芥菜型油菜重要的品质性状，包括芥酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等。其中，芥酸是油料作物重要的有害脂肪酸，大量饮食对心肌纤维、发育、生殖力等都有危害(张书芬等，2008)。我国规定甘蓝型油菜新品种的芥酸含量≤3%(李培武等，2003)。而芥菜型油菜由于低芥酸种质资源的匮乏，导致低芥酸芥菜型油菜品种还没有出现。硬脂酸是饱和脂肪酸，长期食用可降低体内胆固醇含量(刘立侠等，2005)。油酸是单不饱和脂肪酸，具有降低胆固醇、降血糖，降酯密度等的作用(张宏军等，2008)。此外，亚麻酸和亚油酸属于多不饱和脂肪酸，具有抗血栓、降血压、抗老化等功效，但如果含量过高会导致食用油易氧化而缩短货架期(Tian et al, 2014)。因此，加强脂肪酸的研究对于指导芥菜型油菜的育种，增强人们的身体健康具有重要的意义。

油菜种质资源脂肪酸含量的变异及不同含量之间的相关性分析在甘蓝型油菜中开展较多(高志宏等，2013；黄桃翠，2014；刘念等，2014;王健胜和侯桂玲，2015；王健胜等，2015)。蔡东芳(2013)搜集192份甘蓝型油菜品种和自交系的自然群体，分析不同材料的脂肪酸变异，对不同脂肪酸间的相关性及主成分进行了分析，同时还获得了与这些品质性状紧密连锁的SSR和AFLP标记。陈碧云(2014)对488份从全球搜集的甘蓝型油菜的种质资源进行了脂肪酸含量变异和农艺性状的评价，从中发现了许多优良的育种材料，同时获得了与部分重要农艺和品质性状相关联的SNP标记。林宝刚等(2010)对117份国外甘蓝型油菜种质资源的脂肪酸含量进行了聚类分析, 并研究了它们之间的遗传亲缘关系, 通过分析获得了大量优异育种材料。相对而言，芥菜型油菜中脂肪酸含量的相关研究较少。

FAE1基因是调控长链脂肪酸芥酸合成的基因，其最早是在拟南芥的突变体中被发现和鉴定出来的(James & Dooner, 1990; Lemieux et al, 1990)。在甘蓝型油菜中，Fourmann et al (1998)根据拟南芥中FAE1的基因序列设计了兼并引物， 并对此基因进行扩增和测序，共获得了2个FAE1基因拷贝，分别是BN-FAE1.1和BN-FAE1.2。Barret et al (1998)

也在甘蓝型油菜中扩增出了芥酸调控基因FAE1的2个拷贝: CE7(1 647 bp，编码506个氨基酸)和CE8(1 654 bp，编码505个氨基酸), 同时还进一步证实了其是甘蓝型油菜中芥酸的调控基因。Das et al(2002)在白菜(B.campestris, AA, 2n=20)和甘蓝(B.oleraceaCC, 2n=18)中分别克隆一个调控芥酸的FAE1基因拷贝，同时发现这两个拷贝与甘蓝型油菜中克隆的FAE1基因有98%的序列相似性。此外，我们还需要关注芥菜型油菜中不同脂肪酸之间的相关性，如在甘蓝型油菜中芥酸和油酸呈负相关(周永明和刘后利，1987)，从而指导芥菜型油菜的育种工作。脂肪酸调控机理研究及其生物合成途径解析，对于从分子水平上指导芥菜型油菜的分子育种和充分挖掘利用其潜在的商业价值，保障人们的身体健康具有重要的意义。

本研究选用34份来自全国各地的芥菜型油菜种质资源，在贵阳环境条件下种植并测定它们的脂肪酸含量，同时对不同脂肪酸间的相关性进行分析，此外还对调控芥酸含量的基因进行了初步扩增。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选用的34份芥菜型油菜种质资源分别来自贵州(6份)、四川(6份)、云南(6份)、湖北(4份)、重庆(3份)、湖南(2份)、陕西(2份)、河南(1份)、江苏(1份)、江西(1份)、内蒙古(1份)、西藏(1份)(表1)，并且具有丰富的表型变异和品质性状变异。我们于2014年10月份将这34份芥菜型油菜种质资源种植于贵州大学农场，每份材料播种2行，每个材料于开花期随机选取3个单株套袋自交并收取自交种子。

1.2 方法

每份芥菜型油菜取3 g饱满的种子，利用近红外方法测定其种子的脂肪酸含量。每份材料重复测定2次，并取其均值作为该材料最终分析用数据。脂肪酸含量以%表示。

在苗期，采集全部材料的幼嫩叶片提取DNA(Somers et al，1998)。根据美国国立生物技术信息中心 (NCBI，National Center for Biotechnology Information, 网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因序列信息，分别搜索到芥酸调控的关键基因“FAE1”的关联序列，然后利用引物设计软件Primer Premier 6设计其特异引物，并在全部34份研究材料中进行了PCR扩增。PCR产物在2%的琼脂糖胶上检测并照相。

1.3 统计分析

所得的数据利用SPSS 20软件进行分析，包括描述性统计、正态分布图、相关性分析等。

2 结果与分析

2.1 群体性状变异

来自贵阳以外的34份芥菜型油菜种质资源群体在贵阳环境条件下的重要脂肪酸：芥酸、油酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻酸含量变异丰富，均呈现正态分布(图版Ι)。从图版Ι可以看出，此群体材料的芥酸含量均值为52.5%，变异系数为6.3%；油酸含量均值为12.4%，变异系数为27.1%；硬脂酸含量均值为0.1%，变异系数为175.6%；亚油酸含量均值为16.0%，变异系数为8.7%；亚麻酸含量均值为9.2%，变异系数为2.7%。

从表2可以看出，芥酸含量在44%～48%间的材料有3份，占全部材料的8.8%；芥酸含量在48%～52%间的材料有9份，占全部材料的26.5%；芥酸含量在52%～56%间的材料有18份，占全部材料的52.9%；芥酸含量在56%～60%间的材料有4份，占全部材料的11.8%。硬脂酸含量在0.0%～0.2%间的材料有21份，占全部材料的61.8%；硬脂酸含量在0.2%～0.4%间的材料有8份，占全部材料的23.5%；硬脂酸含量大于0.4%的材料有4份，占全部材料的11.8%。亚油酸含量在13%～15%间的材料有10份，占全部材料的29.4%；亚油酸含量在15%～17%间的材料有16份，占全部材料的47.1%；亚油酸含量大于17%的材料有8份，占全部材料的23.5%。油酸含量在6%～10%间的材料有8份，占全部材料的23.5%；油酸含量在10%～14%间的材料有15份，占全部材料的44.1%；油酸含量在14%～18%间的材料有8份， 占全部材料的23.5%；油酸含量大于18%的材料有3份，占全部材料的8.8%。亚麻酸含量在8.4%～8.7%间的材料有1份，占全部材料的2.9%；油酸含量在8.7%～9.0%间的材料有5份，占全部材料的14.7%；油酸含量在9.0%～9.3%间的材料有14份，占全部材料的41.2%；油酸含量大于9.3%的材料有14份，占全部材料的41.2%。

表 2 贵阳环境条件下芥菜资源材料脂肪酸含量变异情况统计表

图版 Ⅰ 芥菜型油菜种质资源群体脂肪酸含量的正态分布 A. 芥酸； B. 油酸； C. 硬脂酸； D. 亚油酸； E. 亚麻酸。Plate Ⅰ Normal distribution of the fatty acids of B. juncea germplasm resoures A.Erucic acid； B. Oleic acid； C. Stearic acid； D. Linoleic acid； E. Linolenic acid.

性状Trait芥酸Erucicacid油酸Oleicacid硬脂酸Stearicacid亚油酸Linoleicacid油酸Oleicacid-0．70∗∗(P=0．00)硬脂酸Stearicacid-0．28(P=0．11)0．34(P>0．05)亚油酸Linoleicacid-0．15(P=0．38)-0．10(P=0．56)-0．21(P=0．24)亚麻酸Linolenicacid0．12(P=0．48)0．10(P=0．59)0．50∗∗(P=0．00)-0．36∗(P=0．04)

注： **. 在 0.01 水平(双侧)上显著相关。*. 在 0.05 水平(双侧)上显著相关。

Note: **.Significant correlation at 0.01 level.*. Significant correlation at 0.05 level.

图版 Ⅱ 芥菜型油菜种植资源材料主成分分析聚类图Plate Ⅱ PCA analysis of 34 B. juncea accessions

2.2 相关性分析

对芥菜型油菜群体的芥酸、油酸、硬脂酸、亚麻酸和亚油酸含量间的相关性进行了分析(表3)。由表3可知，芥酸和油酸间表现出极显著负相关，相关系数为-0.70。亚麻酸和硬脂酸表现出极显著的正相关，相关系数为0.50。亚麻酸和亚油酸呈现显著负相关，相关系数为-0.36。此外，芥酸与硬脂酸、芥酸与亚油酸、油酸与亚油酸、硬脂酸与亚油酸之间均呈负相关，但相关性不显著。油酸与硬脂酸、芥酸与亚麻酸、油酸与亚麻酸之间均呈正相关，且相关性不显著。

2.3 聚类分析

以芥菜型油菜群体材料的脂肪酸含量(芥酸、硬脂酸、亚油酸、油酸和亚油酸)为主要参考指标，对34份材料进行了主成分分析。其中，主成分因子1(PCA1)能解释群体材料40.0%的表型变异，而主成分因子2(PCA2)能解释群体材料31.7%的表型变异，二者一起可以解释群体材料71.7%的表型变异。

以PCA1为X轴，以PCA2为Y轴做散点图(图版Ⅱ)。从图版Ⅱ可以发现，绝大部分材料(30份，占88.2%)集中在图中虚线圆圈所示的区域，而少数其它材料散落在图中，他们分别是T6342(图中编号：8)、长阳黄芥(10)、SL63(19)和棱角油菜(22)。这些变异较大的脱离群体的材料，在芥菜型油菜的育种中可以发挥特殊作用。

2.4 FAE1基因引物设计

芸苔属的芥酸、油酸、硬脂酸、亚麻酸和亚油酸处在同一个代谢调控网络中(Jadhav et al，2005)(图版Ⅲ)。其中， 芥酸主要受基因FAE1的调控， 为深入研究芥菜型油菜中芥酸调控的分子机理及克隆芥酸调控基因，我们特意选取甘蓝型油菜(GU325731.1)和来自甘蓝(HM362927.1)中FAE1基因的表达序列并设计了FAE1基因的特异引物(正义链:5′-CAACAAGGAGACGATGAGA-3′；反义链:5′-CAACAAGGAGACGATGAGA-3′)。同时，利用此引物对群体中芥菜型油菜的种质资源进行了PCR扩增， 琼脂糖胶显示此引物在全部34份材料中都能扩增出378 bp的条带来，且效果较好(图版Ⅲ：B中的第1～34泳道)。甘蓝型油菜包含A和C基因组，而甘蓝只含有C基因组。因此，以上引物在芥菜型油菜中扩增的FAE1拷贝的一部分等同于芸苔属C基因组上的FAE1拷贝。本研究也证实， 芥菜型油菜中至少含有一个FAE1基因拷贝。

图版 Ⅲ 脂肪酸代谢调控网络及FAE1基因片段的扩增 A. 脂肪酸代谢调控网络；B. FAE1基因片段的扩增, 数字1-34分别代表34份芥菜型油菜种质资源。Plate Ⅲ Metabolism network for fatty acids and the amplification of FAE1 gene A. Metabolism network for fatty acids； B. Amplification of FAE1 gene，number 1-34 indicates the 34 accessions of B. juncea.

3 讨论与结论

环境条件可以显著地影响油菜的品质性状，例如温度(钱钧，2004)、生态区差异(王月等，2015)、气候条件(付三雄等，2014; 黄华磊等，2015)、栽培因素(赵继献，2014)等。而贵阳地区具有独特的气候条件，如夏季凉爽和年降水量大，不同来源的芥菜型油菜在贵阳环境下肯定会表现出不同于其来源地的特性。因此，尽可能多地搜集国内外的有关种质资源，加速所收集种质资源在不同地区的及不同环境条件下的筛选工作(谢永俊和曾彪，2007)，是芥菜型油菜育种开展的基本工作。本研究从全国13个省市搜集了34份芥菜型油菜的种质资源，在贵阳环境条件下，这些材料表现出了丰富的脂肪酸变异，并获得部分可以用于芥菜育种工作的优异材料。此外，我们还应加强变异种质资源的人工创造工作，其方法包括：生化试剂(如EMS)(孙妍妍等，2015)、物理因素(如紫外照射)、分子工程(洪林等，2012；马忠岩，2013)和太空育种等。

芥酸、油酸、硬脂酸、亚麻酸和亚油酸的碳原子数目都超过18个，均为超长链脂肪酸，且处在同一脂肪酸合成网路中。本研究发现芥菜型油菜的脂肪酸中芥酸和油酸含量呈显著负相关关系、亚麻酸和硬脂酸含量呈显著正相关关系、亚麻酸和亚油酸含量呈显著负相关关系，这与甘蓝型油菜等其它油料作物中获得的结论相一致(谢立华等，2004；林涛等，2015；温娟, 2015)。不同脂肪酸间错综复杂的相关性(刘兴媛等，1981)，有利于油菜特定的育种目标的开展，如低芥酸和硬脂酸育种，高油酸育种，适中的亚麻酸和亚油酸育种 (涂金星等，2007)。主成分分析作为研究不同种质资源表型相似性的一种重要工具，可以用于划分种质资源的类群和鉴别特异的育种材料(刘海卿等，2015；塔娜等，2015；王健胜等，2015)。本研究通过主成分分析，获得了不同种质资源的相似性关系，同时获得了部分优良的育种材料。除了表型数据可以用于主成分分析外，基于分子标记的基因型数据也可以用于不同种质资源在基因组水平上的相似性研究，这些分子标记技术包括：AFLP、SSR、RFLP、SNP、RAPD。

芥酸是由油酸经过2次碳链延长最终合成的，其合成的每一步均需要FAE1基因的参与。FAE1基因在拟南芥中有1个拷贝(James & Dooner, 1990; Lemieux et al, 1990)，在甘蓝型油菜中有2个拷贝(Fourmann et al，1998；Barret et al，1998), 在白菜和甘蓝中有1个拷贝(Das et al, 2002)。本文选取了来自甘蓝型油菜和甘蓝的FAE1基因已知序列，设计并获得了能快速高效应用的PCR引物并证实芥菜型油菜中至少存在一个FAE1拷贝。研究芥菜型油菜中FAE1基因的分子特性和调控机理对于芥酸的分子育种具有重要意义。例如，在甘蓝型油菜中FAE1基因的超表达，可以将芥酸的含量由47%提高到60%(淮东欣, 2015); 而FAD2基因也被证实可以影响甘蓝型油菜中芥酸的含量，转FAD2基因株系可以将芥酸含量提高13.15%(陈松等，2015)。随着更多芥菜调控基因的获得，分子设计育种将在未来发挥越来越大的作用。

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Variation of fatty acids of Brassica juncea germplasm，correlation analysis and design of specific primer ofFAE1 gene for the control of erucic acid

TIAN En-Tang1*, LI Lu-Feng2, JIA Shi-Yan3, LIN Shu-Chun1

( 1. Oil Crops Research Institute of Guizhou University, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Agricultural ScienceandTechnologyInstituteofXiaoshanDistrictofHangzhouCity, Hangzhou 311200, China; 3.SeedControlstationofXiaoshanDistrictofHangzhouCity, Hangzhou 311200, China )

Brassicajuncea(AABB, 2n=36) is one of the 3rd Brassica oil rape (the other two oil rapes are:B.rapaandB.napus) in China, the species has many desirable traits, such as strong drought resistance and strong resistance to disease and pest. As the important origin ofB.junceaworldwide, China has rich valuable germplasm resources. In this study, we collected 34B.junceaaccessions from all over China, and planted all these accessions with three randomalized replications in Guiyang environment. The fatty acids, including erucic acid, oleic acid, linolenic acid, linoleic acid and stearic acid, was detected by NIR method in this study. All the detected fatty acids showed quantitative and normal distribution in Guiyang environment. Furthermore, we analyzed the correlations among the five above detected fatty acids, the erucic acid and oleic acid are significantly negatively correlated, the linolenic acid and stearic acid are significantly negative correlated, the linolenic acid and linoleic acid are negative correlated. To classify the 34 accessions for better utilization inB.junceabreeding, the principal component analysis (PCA) was used and the results indicated that most of the 34 accessions (30 accessions, about 88.2%) located on one same area, only several other accessions, that was SL63, Lengjiao YC, T6342 and Changyanghuangjie, located on the separate areas. These scattered accessions had special values inB.junceabreeding for their very different traits when comparied with the other accessions. Besides, we BLAST twoFAE1 gene sequences in NCBI website fromB.napus(AACC, 2n=38) andB.oleracea(CC, 2n=18), respectively, which were further used for designing specific primer forFAE1 gene, responsible for the regulation of erucic acid in Brassica species. The primer showed a good amplyfication in the all the 34B.junceaaccessions. So, this study proves that theB.junceagenome contains at least oneFAE1 copy. In conclusion, the study detected the fatty acid content of 34B.junceaaccessions in Guiyang environment and also provides the usefulFAE1 primer for the future gene clone inB.juncea, all of which are valuble in the futureB.junceamolecular breeding of China.

Brassicajuncea, fatty acids, primer design,FAE1, gene amplification

10.11931/guihaia.gxzw201512001

2015-12-01

2016-05-04

国家自然科学基金(31560422)；贵州省科学技术基金(黔科合J字 [2015]2052号)；国家教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留 [2015]1098号)；贵州大学博士人才引进基金(贵大人基合字 [2014]14号)；贵州省作物学省级重点学科建设计划项目(黔学位合字ZDXK [2014]8号) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31560422); Science and Technology Foundation of Guizhou Province of China ([2015]2052); Scientific Research Foundation for Returned Scholars, Ministry of Education of China ([2015]1098); Talent Introducing Foundation of Guizhou University ([2014]14); the Plan of Agronomy Priority Major Construction of Guizhou Province of China ([2014]8)]。

田恩堂(1979-)，男，山东潍坊人，博士，副教授，主要从事油菜分子育种工作，(E-mail)erictian121@163.com。

Q943

A

1000-3142(2016)12-1445-08

田恩堂, 李鲁峰, 贾世燕， 等. 芥菜型油菜脂肪酸含量的变异、相关性分析及芥酸调控基因FAE1特异引物设计 [J]. 广西植物， 2016， 36(12):1445-1452

TIAN ET, LI LF, JIA SY， et al. Variation of fatty acids ofBrassicajunceagermplasm，correlation analysis and design of specific primer ofFAE1 gene for the control of erucic acid [J]. Guihaia， 2016， 36(12):1445-1452

*通讯作者