22q11.2微缺失在贵州少数民族先天性心脏病患者中的研究

龚启华 杨一峰 赵天力 陈金兰 李业涛

(1.贵州省人民医院心脏外科,贵州 贵阳 550002；2.中南大学湘雅二院胸心外科,湖南 长沙 410011 )

22q11.2微缺失在贵州少数民族先天性心脏病患者中的研究

龚启华1杨一峰2赵天力2陈金兰2李业涛1

(1.贵州省人民医院心脏外科,贵州 贵阳 550002；2.中南大学湘雅二院胸心外科,湖南 长沙 410011 )

目的 探索22q11.2微缺失在贵州少数民族先天性心脏病患者中的发病情况。方法 选取44例苗族、侗族及布依族先天性心脏病患者，在UCSC数据库中选择合适的BAC克隆，自制双色BAC探针，采用双色细菌人工染色体-荧光原位杂交技术对上述患者进行22q11.2微缺失检测。结果 在2例法洛四联症患者中检测到22q11.2微缺失，缺失率为4.5%(2/44)。结论 在苗族、布依族、侗族等少数民族先天性心脏病患者中存在22q11.2微缺失现象，对发现的阳性患者应密切观察其行为和认知方面的发育情况，一旦发现异常，应予以积极干预。

少数民族； 双色细菌人工染色体-荧光原位杂交； 22q11.2微缺失； 先天性心脏病

22q11.2微缺失综合征是人类最常见的微缺失综合征，约80%的22q11.2微缺失患者合并某种类型的先天性心脏畸形[1-3]。绝大部分22q11.2微缺失综合征患儿存在学习困难、智力障碍程度不等的认知缺陷[4-5]，该微缺失综合征患者患精神分裂症的风险较普通人群明显增加。全国苗族、布依族、侗族人口主要分布在贵州，目前国内外鲜有关于22q11.2微缺失在苗族、布依族、侗族等少数民族中发病情况的研究。因此，有必要对苗族、布依族、侗族等少数民族先天性心脏病患者22q11.2微缺失发病情况进行研究，以期从分子水平阐明先天性心脏病的发病机理；同时对发现的阳性患者在行为和认知方面给予科学的指导和建议,以提高该类患者的生活质量和社会适应能力。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择贵州省人民医院心脏外科收治的44例苗族、侗族及布依族先天性心脏病患者，所有患者均经心脏彩色多普勒及手术确诊。其中男22例，女22例；年龄7个月至53岁，平均(11.9±10.8)岁；苗族16例，侗族10例，布依族18例；所合并先天性心脏病包括：室间隔缺损16例，室间隔缺损合并房间隔缺损3例，室间隔缺损合并动脉导管未闭1例，室间隔缺损合并肺动脉瓣狭窄1例，室间隔缺损、主动脉瓣脱垂并返流1例，肺动脉瓣狭窄1例，房间隔缺损7例，动脉导管未闭2例，法洛四联症5例，部分型肺静脉异位引流3例，主动脉窦瘤破裂、室间隔缺损并主动脉瓣返流1例，先天性主动脉瓣狭窄1例，先天性主动脉瓣狭窄并关闭不全1例，Ebstein畸形合并房间隔缺损1例。

1.2 方法

1.2.1 选择BAC克隆 在UCSC数据库中根据实验需要选择了2个BAC克隆，其中1个为经典缺失区域远侧克隆，另1个为位于缺失区域中克隆，分别标记不同的荧光颜色，所选BAC克隆及标记情况见表1。

表1 所选BAC克隆及标记情况

1.2.2 制片 将肝素抗凝的患者外周血接种于外周血淋巴细胞培养基内，37 ℃培养箱内悬浮培养72 h后进行收获。调定细胞悬液浓度，用100 μL移液器吸10 μL滴片,稍干,将玻片依次放入70%、90%、100%乙醇中各2 min，保存于-20 ℃备用。

1.2.3 制备探针 无菌操作台上，接种BAC菌种于含氯霉素(氯霉素终浓度为30 μg/mL)的固体LB平板中，37 ℃培养箱内培养过夜。从平板中挑取单个细菌克隆转入含氯霉素(氯霉素终浓度为30 μg/mL)的5 mL液体LB培养液中，空气摇床上37 ℃，300 rpm，振荡培养12～16 h。DNA的分离提纯采用QIAGEN公司的QIAGEN Large-Construct Kit抽提，具体操作按说明书进行。提纯后用核酸测定仪测定所获BAC-DNA的浓度(200～500 ng为宜)，采用缺口平移标记法标记探针(Nick Translation kit，vysis 公司)。取标记好的探针5 μL,运用1%琼脂糖凝胶电泳检测，探针片段在200～500 bp为宜。取标记好的探针45 μL，加入1 μL E．coli tRNA(5 μg/μL)、5 μL鲑鱼精DNA(10 mg/mL)、6 μL 8M醋酸胺、1 μL糖元 (10 mg/mL)及200 μL无水乙醇，-70℃放置30 min，4 ℃ 15 000 rpm离心10 min，去上清，加入200 μL 70%乙醇，4 ℃ 15 000 rpm离心5 min，吸去乙醇，加入甲酰胺15 μL，室温避光溶解20 min后-20 ℃保存。

1.2.4 荧光原位杂交 取7.5 μL已变性好的杂交液滴置已变性干燥的玻片杂交区，封片后置密闭湿盒中37 ℃杂交48 h。从培养箱中取出玻片，去除封片胶。将玻片置于已预温至43 ℃的50% Formamide /2×SSC洗涤15 min、50% Formamide /2×SSC洗涤15 min、2×SSC洗涤5 min、1×SSC洗涤5 min、0.1%Triton X-100/4×SSC洗涤5 min、4×SSC 洗涤5 min、4×SSC洗涤5 min及2×SSC洗涤5 min，室温下依次过70%、90%及100%乙醇各2 min，室温下干燥后加DAPI 15 μL染色、盖上盖玻片。

1.2.5 观察记录结果 采用Leica DM5000B荧光显微镜对杂交片子进行观察，并对杂交结果进行拍照保存。

2 结 果

44例患者中在2例法洛四联症患者检测到22q11.2微缺失，总缺失检出率为4.5%。见图1。其余患者中未检测到22q11.2微缺失存在。

注：绿色信号代表对照组探针，红色信号代表实验组探针。探针组合：CTD-2335H16(绿色)+RP11-316L10(红色)；两图中绿色信号为2个，红色信号均为1个，表示该2例患者均存在22q11.2微缺失。 图1 a、b分别为2例22q11.2微缺失检测阳性患者FISH检查结果。

3 讨 论

22q11.2微缺失综合征临床表现变异较大，包括心脏畸形、特殊面容、认知缺陷、精神疾病、行为异常、免疫缺陷、腭裂、甲状旁腺缺如或发育不良等[6-12]。22q11.2微缺失综合征被认为是除21-三体综合征以外的引起先天性心脏畸形最常见的遗传因素，其所合并的先天性心脏畸形是导致22q11.2微缺失综合征患者早期死亡的主要原因，往往需要进行外科手术矫治。

在以往研究中先天性心脏病患者22q11.2微缺失综合征的发病率差异较大。Agergaard 等[13]认为22q11.2微缺失综合征在先天性心脏病患者中的发病情况与研究人群所患心脏畸形种类、年龄范围及是否合并心外畸形等纳入标准密切相关。在主动脉弓中断、永存动脉干、肺动脉闭锁合并室间隔缺损以及法洛四联症4种圆锥动脉干畸形中，22q11.2微缺失综合征具有较高的发病率。但在房间隔缺损、室间隔缺损、左心发育不良综合征及心室双入口等非圆锥动脉干畸形中也存在合并22q11.2微缺失综合征的报道，病理机制尚不明确[13-14]。在本组研究中，共在2例法洛四联症患者中发现存在22q11.2微缺失，发病率为4.5%(2/44),明显低于上述研究;且在房间隔缺损、室间隔缺损等非圆锥动脉干畸形中未发现合并22q11.2微缺失。导致上述差异出现的原因考虑与以下因素有关：(1)由于本心脏中心所处地区的经济社会原因，大部分较复杂的圆锥动脉干畸形患者未能就诊接受手术治疗，使本组研究中圆锥动脉干畸形患者病例数比例较上述研究偏低。(2)本组研究对象总样本量偏小。在今后的研究中我们将扩大样本量及所纳入心脏畸形的范围，更加准确地反映22q11.2微缺失综合征在苗族、布依族、侗族等少数民族先天性心脏病患者中的发病情况。

绝大部分22q11.2微缺失综合征患儿存在学习困难、智力障碍程度不等的认知缺陷[4-5]。22q11.2微缺失综合征还与行为及精神异常密切相关，该类患者患精神分裂症的风险较普通人群明显增加。研究[15-16]发现, 大约22.6%～25%的22q11.2微缺失综合征患儿在青少年期或成人期发展为精神分裂症。本研究中，1例学龄患儿存在语言发育迟缓，已向患者家属推荐进行干预治疗。由于本组研究对象年龄偏小、随访时间偏短，暂未发现精神异常情况的发生，但随着患儿的成长及随访时间的延长，有可能将面临这一问题。我们已对接受随访的患儿家属进行宣教，以期早期发现患儿成长过程中的精神异常情况，并及时予以治疗。

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Study on 22q11.2 microdeletion in patients with congenital heart disease in the minority in Guizhou province.

GongQihua1,YangYifeng2,ZhaoTianli2,ChenJinlan2,LiYetao1.

1.DepartmentofCardiacSurgery,theGuizhouProvincialpeople'sHospital, 550002,P.R.China. 2.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,SecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China.

Objective To determine the frequency of 22qll.2 microdeletions in patients with congenital heart disease in the Miao, Dong and Buyi minorities in Guizhou province. Methods A total of 44 patients with congenital heart disease，22 female and 22 male , ranging in age from 0.58 to 53 years, were included in our study. The dural-color bacterial artificial chromosome (BAC) fluorescence in situ hybridization with RP11-316L10/CTD-2335H16 probe was used to find the chromosome 22qll.2 deletion in peripheral blood cells of patients.Results Chromosome 22qll.2 microdeletion was detected in 2(2/44) patients with tetralogy of fallot. The total frequency of 22qll.2 deletion was 4.5%. Conclusion There is 22qll.2 microdeletion in Miao, Dong and Buyi minorities.

Minority； Dural-color bacterial artificial chromosome fluorescence in situ hybridization； 22q11.2 microdeletion； Congenital heart disease

贵州省科学技术基金[黔科合J字(2009)2317]

R654.2

A

1002-6975(2016)04-0351-03

2015-09-12)