AURKA基因在口腔鳞癌中的表达及意义

邹苑 陈浩 马洪

(贵州医科大学附属口腔医院颌面外科，贵州 贵阳 550004)

AURKA基因在口腔鳞癌中的表达及意义

邹苑 陈浩 马洪△

(贵州医科大学附属口腔医院颌面外科，贵州 贵阳 550004)

目的 检测极光激酶A(AURKA)基因在口腔鳞癌中的表达及意义。方法 收集20例口腔正常组织及42例口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织，采用Real-Time PCR检测AURKA基因在不同口腔组织中的表达。结果 AURKA mRNA在OSCC中高表达，且不同分化程度，不同临床分期，组间差异有统计学意义。不同年龄，不同性别，组间差异无统计学意义。结论 AURKA在OSCC中高表达，AURKA作为激酶可能直接或间接地激活多种致癌蛋白或使多种抑癌蛋白失活，从而推动肿瘤的发生发展。

极光激酶A； 口腔鳞癌； Real-Time PCR

极光激酶A(AURKA)基因编码是一个定位于中心体上的丝氨酸苏氨酸激酶，属于激酶家族成员之一[1]。研究表明AURKA是一个周期性蛋白，在有丝分裂期后期开始定位于中心体，并且累积直到下一个周期的早期才被降解。通过参与中心体的复制、分离和成熟，在有丝分裂的细胞周期中起着重要作用。在纺锤体的两极，其功能的正常发挥对细胞染色体准确地平均分离到两个子代细胞具有重要影响。AURKA的异常表达或功能缺陷往往导致染色体异倍性的产生，由此产生的基因组不稳定性被认为是肿瘤形成的重要原因之一。目前已知乳腺癌[2]等多种人类肿瘤中发现其异常扩增或高表达。但在口腔癌中的表达情况鲜有报道，本研究应用Real Time PCR检测AURKA在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达情况，并比较其在不同临床特征组中表达的差异，为OSCC的早期发现、早期诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 组织标本及临床资料 所有口腔鳞癌及正常组织标本来自贵州医科大学附属口腔医院颌面外科，收集时间2013年9月至2015年9月，包括口腔鳞状细胞癌42例和正常组织20例，OSCC组织系颌面外科手术切取，正常组织来源于颌面外科拔牙患者的健康牙龈，所有OSCC均经贵州医科大学病理科证实，所有标本的获得均经贵州医科大学伦理学会审核通过。

1.2 实验试剂 mRNA抽提试剂盒Dynabeads○RmRNA DIRECTTM、逆转录试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR扩增试剂 Light Cycler○R480 SYBR Green ⅠMaster 购自Roche公司。

1.3 引物合成 根据参考文献[3]设计引物。AURKA 基因上游：cgccctgtaggatctgctt;下游：caaatatccccgcactctg。内参引物POLR2A基因上游：gcaaattcaccaagagagac，下游：cacgtcgacaggaacatcag。引物由大连宝生物有限公司合成。

1.4 实验设备 实验专用纯水机WP-UP-IV120(四川沃特尔)，高压锅(苏泊尔)，4 ℃冰箱(海尔电器)，热恒温培养干燥箱(上海跃进医疗机械厂)，各规格微量移液器(Eppendorf,德国)，超净工作台(苏州净化设备公司)，自动立式电热蒸汽压力灭菌器(上海博讯实业医疗设备有限公司)，压力蒸汽灭菌器(开阳医疗器械厂，YXQ-SG46-28)，CFX connect Real Time System PCR仪(美国伯乐BIO-RAD公司)。

1.5 Real-Time PCR 利用磁珠法提取组织mRNA：从存储在RNALATER试剂(-80 ℃)的组织中切取1 mm×2 mm大小组织，加入蛋白溶解酶K，55 ℃恒温箱中消化。直到肉眼看不到任何组织，再加入40 μL Dynabeads dT25在摇床上摇晃10 min，立即放入磁珠中。移除上清液并用BufferA/B液顺次洗涤。加入Tris-HCL，溶解磁珠并放入80 ℃恒温箱2 min，再用于从磁珠中获取mRNA。最后将收集来的大约13 μL mRNA(在Tris-HCL中的)直接加入事先准备好的7.5 μL cDNA Synthesis Master Mis中。将样品放入热循环仪中，42 ℃中维持30 min，然后85 ℃维持5 min，最后4 ℃维持5 min。循环结束后便获得逆转录来的cDNA，-20 ℃储存备用。将上述合成的cDNA上样至10 μL反应体系：SYBR Green ⅠMaster 5 μL，上下游引物 4.0 μL，模板1 μL。用CFX connect Real Time System PCR仪进行扩增，反应条件为：预变性95 ℃维持 1 min，变性95 ℃ 维持10 s，退火65 ℃ 维持30 s，共64个循环。每个样品3个复孔，取CT平均值，采用相对定量法结果分析[4]。

1.6 统计学处理 采用SPSS 10．0软件包进行统计分析，检测结果结合临床资料数据，P<0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

正常黏膜和OSCC组织中均检测到AURKA mRNA的表达。AURKA mRNA在OSCC中的表达(0.38±0.21，n=42)明显高于其在正常黏膜(0.38±0.21，n=20)中的表达，组间差异有统计学意义(z=-2.153，P<0.05)。在各个临床指标的对比分析见表1。

表1 AURKA mRNA表达与口腔鳞癌临床特征的相关性

3 讨 论

AURKA基因编码是一个进化上保守的丝氨/苏氨酸激酶，是Aurora激酶家族成员之一。在有丝分裂中，AURKA通过参与中心体的分离和成熟以及纺锤体两极的建立，确保有丝分裂中染色体的正确分离和胞质分裂的顺利完成，在细胞周期中起着重要作用[5]。近年来的研究表明，AURKA可参与多条重要的细胞信号通路，作为激酶直接或间接地激活多种致癌蛋白或使多种抑癌蛋白失活，从而推动肿瘤的发生发展。已有的研究表明，AURKA在异常情况下也是一个癌基因，且在多种人类肿瘤中均有报道存在AURKA的基因扩增和过表达现象。AURKA高表达，在衰减p53[6]和p73[7]肿瘤抑制功能上起着重要作用。另有研究[8]表明AURKA的高表达通过上调抗调亡效应因子NF-kB，在阻止癌细胞调亡中起着关键作用。然而AURKA参与肿瘤发生发展的分子作用机制迄今尚不清楚。本研究证实AURKA在42例OSCC中呈高表达，且与OSCC临床分期及分化程度有关，但其在OSCC发生发展中的分子作用机制有待进一步探究。

[1] Dar AA, Goff LW, Majid S,et al. Kinase inhibitors-rising stars in cancer therapeutics[J].Mol Cancer Ther,2010,9:268-278.

[2] Ali HR, Dawson S, Blows FM, et al. Caldas C:aurora kinase a outperforms Ki67 as a prognostic marker in ER-positive breast cancer[J].Br J Canc,2012,106:1798-1806.

[3] Muy-Teck The, Iainl Hutchison. Exploiting FOXM1-orchestrated molecular network for early squamous cell carcinoma diagnosis and prognosis[J].International Journal of Cancer, 2012,10: 2095-2106.

[4] Fiedler SD,Carletti MZ,Christenson LK. Quantitative RT-PCR methods for mature micro RNA expression analysis[J].Methods in Molecular Biology，2010,630:49-64.

[5] Lindon C,Grant R,Min M.Ubiquitin-mediated degradation of aurora kinases[J].Frontiers in Oncology,2014,5(24)：1-13.

[6] Katayama H,Sasai K,Kawai H,et al.Phosphorylation by aurora kinase a induces mdm2-mediated destabilization and inhibition of p53[J].Nat Genet，2004，36:55-62.

[7] Dar AA,Belkhiri A,Ecsedy J,et al.Aurora kinase a inhibition leads to p73-dependent apoptosis in p53-deficient cancer cells[J].Cancer Res，2008，68:8998-9004.

[8] Sun C,Chna F,Briassouli P,et al.Aurora kinase inhibition downregulates NF-kappaB and sensitises tumour cells to chemotherapeutic agents[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,352(1):220-225.

Expression and significance of AURKA gene in oral squamous cell carcinoma

ZhouYuan,ChenHao,MaHong.

DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,AffiliatedOralMedicalHospital,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To detect the expression of Aurora kinase A (AURKA) gene in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Methods 20 patients with oral normal tissue and 42 patients with OSCC were collected. Then the expression of AURKA gene was detected in different dental tissue by Real-Time PCR. Results The high expression of AURKA mRNA was detected in the OSCC tissue. There were statistical significantly differences between differentiation of different levels and different clinical stages, and no significant differences between different ages and different sexes. Conclusion The expression of AURKA is high in the OSCC. The AURKA may directly or indirectly activate multiple cancer proteins, or make a variety of inactivation of tumor suppressor proteins, and promote the development of cancer.

AURKA; Oral squamous cell carcinoma; Real-Time PCR.

贵州省国际合作计划项目 [黔科合外G字(2014)7009号]

R739.8

A

1002-6975(2016)04-0358-02

2015-10-10)

△通信作者，E-mail：mahong1966@126.com