淫羊藿苷/壳聚糖/血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料治疗兔桡骨骨缺损疗效的实验研究*

张传志曹洪辉 李修建 蔡 明 周 庾 胡晓波 卢卫忠 张太君

（重庆市中医院，重庆 400016）

·研究报告·

淫羊藿苷/壳聚糖/血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料治疗兔桡骨骨缺损疗效的实验研究*

张传志△曹洪辉 李修建 蔡 明 周 庾 胡晓波 卢卫忠 张太君△

（重庆市中医院，重庆 400016）

目的观察淫羊藿苷/壳聚糖/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料提高骨缺损愈合的疗效。方法

淫羊藿苷 富血小板血浆 生长因子 骨缺损 骨修复

骨缺损指骨的结构完整性被破坏，创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。典型的缺损局部临床表现，结合X线检查，即可明确诊断［1］。尽管骨折治疗的方式与方法有较大的进步，但是骨缺损的发生频率仍然较高。骨缺损是临床治疗中的一个棘手问题和挑战，往往给患者及社会带到沉重负担。促进骨缺损修复，从而缩短临床治疗时间和保留患者肢体功能，避免和减少劳动力丧失，降低医疗费用等均具有重要意义。研究表明血小板血浆（PRP）、中药淫羊藿苷能够促进骨修复［2-3］，复合两种物质是否更进一步促进骨修复效应及是否可行尚未见报道。我们推测，如果能够通过工程技术，通过构建壳聚糖富血小板血浆载药微球和淫羊藿苷羟基磷灰石支架，同时实现生长因子和中药淫羊藿局部缓放释放，可能更有效影响骨缺损的进程。本实验基于上述设想，通过构建淫羊藿苷/血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/CS/HA），并且移植入骨缺损模型局部，通过常规X线摄片、组织形态光学检查及生物力学试验等方法检测EP/PRP/CS/HA复合材料对兔骨缺损修复的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 由动物购买于第三军医大学大坪实验动物中心。实验地点位于第三军医大学实验动物中心。选取健康新西兰大白兔48只，体质量2.5～3.0 kg，雄性，普通级饲养。所有兔按随机数字表法分为3组，每组16只：模型组（行骨缺损手术）；PRP/CS/HA组（行骨缺损手术，植入微球羟基磷灰石复合材料）；EP/ PRP/CS/HA组（行骨缺损手术，植入淫羊藿苷微球羟基磷灰石复合材料）；术后均观察共12周。该实验通过重庆市中医院实验动物伦理委员会同意。实验程序严格按照动物实验规范及指南进行。所有动物均给予人文关怀。

1.2 仪器与试剂 冷冻干燥机，北京博医康FD-1A-80；恒温震荡机，万合仪器THZ-D；万能试验机，上海企想检测仪器有限公司QX-W600；切片机，德国SLEE冷冻切片机MNT；倒置光学显微镜，上海蔡康光学仪器厂XDS-200C；X线机，北京岛津医疗有限公司BR-120M。羟基磷灰石，Amresco，上海信裕生物科技有限公司；壳聚糖，MERCK MILLIPORE，上海钰博生物科技有限公司；淫羊藿苷，Amresco，上海信裕生物科技有限公司；乙酸，重庆齐星化工；2%NaOH，重庆齐星化工；无水酒精，重庆齐星化工；水合氯醛，重庆齐星化工；Span80，天津市光复精细化工有限公司；异丙醇，重庆齐星化工；无水乙醚，重庆齐星化工；华创防AO钢板，广州华正医疗；五水头孢唑啉，深圳华润九新药业有限公司；EDTA，重庆齐星化工；多聚甲醛，重庆齐星化工；二甲苯，重庆齐星化工。

1.3 材料制备与模型构建 1）EP/CS/HA复合支架材料。精确称量HA、CS（HA∶CS）的比例5∶5质量比）的粉体后，放入盛有淫羊藿溶液（淫羊藿的质量占总质量的10%）的烧杯中，加入一定量蒸馏水，使有机相浓度介于2.5%~10%（W/V）之间，再加入一定量的乙酸溶液，使CS充分溶解。将该混合物于40℃水浴中充分搅拌成乳液状后，超声波处理消除气泡。将此乳液倾入金属模具（Φ4 mm×15 mm），在4℃的冰箱中冷藏过夜，然后分别在-20℃、-80℃下预冷冻48 h后，真空冷冻干燥48 h，得EP/CS/HA复合支架材料。用含2%NaOH的乙醇溶液浸泡2 h中和乙酸，蒸馏水冲洗，二次冷冻干燥后备用［4］。所有支架材料均采用20 kGy60Co辐照灭菌消毒标记备用。2）富血小板血浆微球（CS-PRP）构建。采用水合氯醛腹腔注射的方法进行麻醉 （10%，400 mg体质量）。先给予总量的2/3，根据麻醉效果追加麻药。麻醉成功后兔取俯卧位，四肢绑缚固定。备皮消毒，从兔耳中央动脉抽取5 mL血，装在预先放有0.5 mL复方枸橼酸钠抗凝剂的10 mL离心管中，参照文献［5］法进行PRP提取：将新鲜血分2次离心，第1次离心200 g×10 min，吸管吸取全部上清液至交界面下3 mm，移至另一离心管，平衡后再次离心200 g× 10 min，此时离心管中液体分为两层，吸取约3/4上清液弃掉，摇匀剩余液体，即为PRP（约0.5 mL），摇匀，备用。将壳聚糖溶于5%的醋酸溶液中，得到3%的壳聚糖溶液；PRP加入3%的壳聚糖溶液10 mL中并充分搅拌（体积比1∶1），制成壳聚糖/PRP混合液。在500 mL烧杯中加入100 mL无菌液体石蜡，1 mL Span80，一定速度磁搅拌下逐滴加入壳聚糖/PRP混合液10 mL，使水油比达到1∶10，常温下搅拌，乳化15 min。反应完成用3号砂芯漏斗真空抽滤，用异丙醇、无水乙醚反复冲洗，静置备用。制作过程严格无菌操作。3）淫羊藿苷/壳聚糖/血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/ CS/HA）构建。将富血小板血浆微球（CS-PRP）置入一定量PBS缓冲液中，淹没Ep/CS/HA复合支架材料，恒温匀速震荡1 h备用。

1.4 手术方法 按照参考文献［6］的方法建立兔桡骨骨缺损模型。实验采用随机分组，所有兔手术操作都是由有经验的骨科医生在无菌环境下完成。腹腔内注射注射用五水头孢唑啉（按100 mg/kg给予）。备皮，碘伏消毒，铺巾。以兔双侧桡骨中分为中心做约6 cm的纵向背侧切口。逐层解剖暴露桡骨。根据兔桡骨“s”形将6孔钢板（华创仿AO宠物用钢板）塑形贴伏满意后将钢板置入背外侧，依次于远近两端钻孔测深，远端1枚螺钉初步固定钢板不锁紧，将钢板向下移开，于远近螺钉孔等距用线锯截骨，断端间截骨长度1.5 cm，并注意去除截骨边缘骨膜组织和桡尺骨间膜。将钢板复位，逐一安放螺钉，骨缺损模型完成。根据试验分组于左侧植入EP/PRP/CS/HA复合材料或PRP/CS/HA复合材料；右侧空白对照。依次缝合肌肉，皮肤。术后次日，第3日再次给予相同剂量五水头孢唑啉2次。伤口换药每2日1次。

1.5 术后常规观察 1）术后常规观察新西兰兔在手术后的进食多少、伤口感染或愈合等情况。2）X线摄片检查。第12周时间点，A组、B组、C组麻醉下进行x线检查（52 kV，1.4 mAs），并根据结果对不同分组骨缺损修复情况进行研判。3）生物力学检测。10%水合氯醛麻醉，空气栓塞法处死兔后取桡骨全长，剔除所有软组织并去除钢板螺钉，采用电子万能试验机测定骨痂进行生物力学检测。随机选取3个组的6个骨样本。4）组织形态学检测。取3组骨痂置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。进一步使用10%EDTA脱钙处理，以达到针刺入效果为准。后继使用70%，80%，70%，90%，95%，100%酒精梯度脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明处理后，然后石蜡包埋，按层厚100 μm切片。石蜡切片用VG染色、H&E染色与三色染色后，普通倒置显微镜下观察（100×）。通过HE组织形态学检测检测方法，以评估不同疗效。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件处理。计量资料以（s）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对饮食、伤口感染情况的影响 所有术后感染发生在术后3 d至1周出现感染。模型组感染数为5例，阴性数为11例，感染率为45.5%。PRP/CS/HA为感染数为3例，阴性数为13例，感染率为23.0%。EP/PRP/ CS/HA感染数为1例，阴性数为15例，感染率为6.3%。EP/PRP/CS/HA组感染率与模型组、PRP/CS/HA组相比较，感染率明显降低（P＜0.01），所有感染动物剔除实验。

2.2 术后12周影像学检测结果 12周时，X线提示模型组：断端间有低信号组织生长，形态欠规则；PRP/ CS/HA组有较多骨痂生长，骨折线稍模糊，但骨痂密度较正常骨结构偏低，无明显塑形改建表现；Ep/PRP/ CS/HA组则显示骨痂生长良好，断端间骨折线消失，可见骨小梁结构出现。

图1 X线片观察不同组间骨折愈合情况

2.3 术后12周组织形态学检测结果 A组 可见较多脂肪组织和纤维组织结果，少许骨性组织。B组较多骨痂形成。 C组可见较多骨痂形成，排列较为紧密，骨痂成同向排列。

图2 HE染色观察不同组间骨折愈合情况（染色，倍数）

2.4 生物力学结果 所有测定标本均从桡骨缺损中间部位断裂，断端不整齐。生物力学测定结果发现最大抗压强度PRP/CS/HA组为 （88.83±2.32）Mpa，与EP/PRP/CS/HA组的（95.67±3.83）Mpa间差异无统计学意义（P＞0.05）。和模型组的（4.86±1.02）Mpa差异有统计学意义（P＜0.05）。PRP/CS/HA组的断裂弯曲度为（2.05±0.24）mm，与 EP/PRP/CS/HA组的（2.92± 0.38）mm间差异无统计学意义（P＞0.05）。和模型组的（1.56±0.33）mm差异有统计学意义 （P＜0.05）。说明B、C组均能促进骨修复和重塑，从而提高抗弯曲力度。

3 讨 论

骨缺损在临床诊疗中常常面临可供骨移植材料不够、患处成骨能力下降的困境，如何在提供有效的容易来源的骨移植材料并提高成骨能力是摆在所有医务人员面前的难题。由于骨缺损的修复需要有移植材料相容性同时具有骨传导性、骨诱导性及骨祖细胞，如果一种移植复合物结合了全部三种骨再生所需要的成分，可望为骨缺损治疗带来莫大好处。目前，传统吻合血管的自体/异体骨移植、人工合成替代物移植等多种方法成为临床常用的骨缺损修复技术［7］。但是这些视为金标准的方法应用过程中存在重大缺陷，如易出现并发症的供骨区、有限的供体来源、而无活性的异体骨虽然不受数量的限制，但是存在排异和传染疾病的可能。近年，骨组织工程技术的实验研究给骨缺损的治疗带来无限发展前景。这些组织工程技术包括多种生物元素，如骨传导性支架、缓释诱导成骨生长因子、负载具有成骨潜能的细胞以及组织工程骨血管化或充足的血供等［8-12］。可见，组织工程技术成为修复骨缺损的趋势，积极开发与研究不同因素的治疗技术成为骨缺损治疗的重要内容。

骨感染一直是骨科的重要难题，常常同时并存骨缺损。若能控制感染同时实现骨缺损的修复可以大大减少患者肢体功能受限的时间和减少医疗费用。淫羊藿苷是提取自小窠科植物中药淫羊蕾的天然黄酮类化合物，是淫羊藿的主要生物活性成分。系列研究表明淫羊藿苷具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗抑郁、抗炎等作用。刘天明等研究表明淫羊藿苷能够提高金黄色葡萄球菌感染的小鼠巨噬细胞的吞噬能力，促进淋巴细胞的增殖，提高淋巴细胞进入S期的百分率，促进淋巴细胞白细胞介素-2和白细胞介素-10的分泌，对巨噬细胞具有免疫调节作用［13］。本研究中因手术时间较长，3组兔均发生不同程度的术后感染，同时也发现构建的Ep/PRP/CS/HA复合移植物在术后感染较其他组明显减低。考虑该移植物缓慢释放的淫羊藿苷通过调节巨噬细胞功能，一定程度上抑制了细菌的生长，从而减低了术后感染，但具体机制仍需进一步研究证实。

中医学认为，肾藏精，主骨；肝藏血，主筋。精血互生、肝肾同源，筋骨相连、肝肾同治并补，可使精充血旺、骨健筋强。肾有掌控骨骼生长的功能，肾精充足，那么人的骨质就会得到很好的滋养，骨骼发育就好，骨质就致密；如果肾精不足，那么骨骼就失去滋养。淫羊藿性温，味辛，归肝肾两经，具有补肾壮阳、祛风除湿之功，是常用中药。《本经》曰“主阴痿绝伤，茎中痛。利小便，益气力，强志”。《日华子本草》言“治一切冷风劳气，补腰膝，强心力，丈筋骨挛急，四肢不任”。文献研究表明，淫羊藿可以有效影响兔颌骨骨缺损的愈合时期［14］。淫羊藿苷对成骨细胞调亡的影响有明显作用［15］。中药淫羊藿苷可以有效影响干预人工关节磨损微粒诱导的骨溶解现象［16］，说明中药淫羊藿苷可能有效影响骨代谢、骨修复过程，目前推测其机理为调整下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能，并呈现性激素作用，调节体内酶、激素水平，促进蛋白质合成等。

生长因子对成骨细胞分化增殖有重要调节作用，如BMP、TGF-β、bFGF、IGF、PDGF等，但目前多为单一生长因子作用观察，部分研究［17］尝试联合两种以上生长因子进行研究，均证实生长因子不同程度上促进了骨修复。但是，体内骨修复过程中多种生长因子序贯、长程作用却成为当前认为是促进骨修复的关键因素。因此，如何改变当前的单一生长因子的作用，实现生长因子长时间，模仿机体内生长因子作用模式仍是组织工程困难所在，也是目前组织工程研究热点和难点。富含血小板血浆（PRP）是自体源性、浓缩的含血小板的血浆，是全血经过分离而得到的血小板浓缩物。在PRP形成富含血小板凝胶（PRG）的过程中，血小板通过脱颗粒作用释放血小板源性生长因子、转化生长因子β1、转化生长因子β2、IGF、表皮生长因子和血管内皮细胞生长因子等，其浓度约为体内正常浓度的3~8倍。因此研究人员［18-20］尝试将PRP复合到各种支架载体上探讨骨修复，取得一定成果，如钟达将PRP和支架复合后证实成骨效应类似自体髂骨［21］，许永伟利用壳聚糖制备PRP载药微球，获得了生长因子的长程释放并促进颌骨缺损的修复［22］。

如果构建一种复合移植材料，同时实现中药淫羊藿苷和生长因子的长程作用，可能有望明显促进骨的修复重建。本研究表明，Ep/PRP/CS/HA复合移植物在兔骨缺损模型12周时影像学检查提示骨痂生长良好，骨折线模糊消失，骨小梁显现，组织学检查提示骨成熟度较高，术后12周的抗压强度相比PRP/CS/HA及模型组更强，断裂弯曲度比后两者更大，具有良好的力学特征，提示该复合材料实现了上述成分的缓释和长程作用。该新方法有望为骨缺损修复提供手术中的理想支架材料，但修复材料在血管化和骨爬行替代并在新的力学环境中逐渐适应自身改造后骨的生物力学性能才会得到明显改善，所以该材料的血管化及骨再生过程等问题有待于进一步研究。其次，中药淫羊藿苷成分非单一成分，构建支架中如何选择使用剂量保证不出现副作用仍需进一步研究。

总之，我们的研究说明Ep/PRP/CS/HA复合材料能够减少骨缺损感染率，提高骨缺损修复。结合中医药的优势和现代西医的研究成果，进行组织工程移植物的构建可能是未来的可行发展方向。但是这种局部应用的副作用及不足之处，仍然需要更多的实验和数据验证。

［1］ 金黎明，刘万顺，韩宝芹.骨缺损治疗方法的研究现状［J］.中国临床康复，2006，10（1）：144-146.

［2］ Okuda K，Kawase T，Momose M，et al.Platelet-Rich plasma contains high levels of platelet-derived growth factor and transforming growth factor-beta and modulates the proliferation of periodongtally related cell in vitro［J］.J Periodontol，2003，74（6）：849.

［3］ Jian Huang，Lan Yuan，Xi Wang，et al.Icariin and its glycosides enhance osteoblastic，but suppress osteoclastic，differentiation and activity in vitro［J］.Life Science，2007，87：832-840.

［4］ 吴涛，南开辉，陈景帝，等.可控释淫羊藿苷的仿生组装骨诱导修复材料［J］.科学通报，2009，54（9）：1198-1206.

［5］ Landesberg R，Roy M，Glickman RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of platelet-rich plasma gel preparation［J］.J Oral Maxillofac Surg，2000，58（3）：297-300.

［6］ 覃昱，裴国献，金丹，等.带血供肌瓣复合BMP微球修复兔桡骨缺损的实验研究［J］.中国临床解剖学杂志，2004，22（60）：656.

［7］ 黄永栋，姜卫平.骨缺损的临床治疗进展［J］.医学综述，2009，15（13），1984-1986.

［8］ Ehrler DM，Vaccaro AR.The use of allograft bone in lumbar spine surgery［J］.Clin Orthop，2000，89（371）：38-45.

［9］ 杨志明，黄富国，秦廷武，等.生物衍生组织工程骨植骨的初步临床应用［J］.中国修复重建外科杂志，2002，16（5）：311-314.

［10］陈伟良，藕小平，王建广，等.人颌骨骨膜成骨细胞复合异体部分脱钙骨的成骨实验研究［J］.口腔颌面外科杂志，2004，14（2）：112-114.

［11］牛玉梅，陈野，李艳萍.犬自体骨髓间充质干细胞介导HA-TCP修复牙槽骨缺损的实验研究［J］.口腔医学研究，2012，28（1）：9-11.

［12］杨为中，周大利，尹光福.磷酸钙/BMP复合生物活性骨水泥水化性能及诱导成骨特性研究［J］.无机材料学报，2005，20（5）：1174-1180.

［13］刘天明.淫羊藿苷对体外金黄色葡萄球菌感染小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的免疫调节效应［J］.饲料研究，2016，39（7）：40-44.

［14］裴玉岩，刘继光，李凌志，等.淫羊藿对骨质疏松家兔颌骨骨缺损愈合的影响［J］.黑龙江医药科学，2011，34（1）：93-94.

［15］张立娟，雷涛，张秀珍.淫羊藿对成骨细胞凋亡的影响［J］.同济大学学报：医学版，2008，29（1）：30-34.

［16］王俊，朱旭日，张超，等.中药淫羊藿苷干预人工关节磨损微粒诱导的骨溶解［J］.中国组织工程研究，2014，18（17）：2625-2631.

［17］左爱军，梁东春，王宝利，等.rhBMP-2对壳聚糖复合成骨细胞后的成骨活性影响［J］.中国生物工程杂志，2006，26（5）：33-37.

［18］Pieri F，Lucarelli E，Corinaldesi G，et al.Effect of mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma on the healing of standardized bone defects in the alveolar ridge：a comparative histomorphometric study in minipigs［J］.J Oral Maxillofac Surg，2009，67（2）：265-272.

［19］Howes R，Bowness JM，Grotendorst GR，et al.Platelet-derived growth factor enhances demineralized bone matrix-induced cartilage and bone formation［J］.Calcif Tissue Int，1988，42（1）：34-38.

［20］黄爱文，金丹，裴国献.复合PRP的可注射型组织工程骨修复兔桡骨缺损的实验研究［J］.第三军医大学学报，2007，29（14）：1374-1377.

［21］钟达.强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料的制备及在体内成骨的研究［D］.长沙：中南大学，2008.

［22］许永伟，周永胜，冯海兰.缓释人富血小板血浆生长因子壳聚糖微球的制备［J］.口腔颌面修复学杂志，2010，11（3）：139-141.

An Experimental Study on the Efficacy of Combined Graft（Epimedium-Chitosan-Hydroxyapatite Loaded with Platelet Rich Plasma Microspheres）on Bone Defect Formation

ZHANG Chuanzhi，CAO Honghui，LI Xiujian，et al. Department of Orthopaedics，Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400016，China.

Objective：To study the efficacy of using combined graft（epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）for bone defect repairing.Methods：48 New Zealand white rabbits with radius bone defect were randomly divided into three groups：Group A：blank control group：bone defect operation；Group B：combined graft group（chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）；Group C：（Epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）.All animals were fixed with plate.Bone repairing efficacy was assessed by hematoxylin eosin histology，X-ray radiography and biomechanical testing methods in 12 weeks after operation.Results：Compared with Group A，X ray showed fracture line began to blur with increased callus（woven bone）in the 12th week in experimental group B and bone fracture line blurred with increased mature stage callus in group C.The postoperative infection rate was lower in group C and had significant difference as compared with the former two groups（P<0.01）.Biomechanical testing showed increased callus bending strength in both group B and group C as compared with group A with statistical significant difference.There were no statistical significant difference between group B and C.Hematoxylin eosin histology showed mainly fibrous connective tissue in group A while massive bone tissue formed in group B and C with mature stage bone tissue in group C.Conclusion：The combined graft（epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with platelet rich plasma microspheres）is expected to be a possible method in bone defect treatment as it shows enhanced bone repairing.

Epimedium；Platelet-rich plasma（PRP）；Bone growth factor；Bone defects；Bone restoration

R683

A

1004-745X（2016）12-2245-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.012

2016-09-15）

重庆市卫计委面上项目基金资助（2013-2-089）

△通信作者（电子邮箱：zhangchuanzhi838@sina.com）

48只新西兰大白兔随机分成3组：A组模型组 （行骨缺损手术）；B组富血小板微球羟基磷灰石PRP/CS/HA（行骨缺损手术，植入PRP/CS/HA复合材料）；C组淫羊藿苷血小板血浆微球羟基磷灰石复合材料EP/PRP/ CS/HA（行骨缺损手术，植入EP/PRP/CS/HA复合材料）。均植入6孔钢板（华创仿AO宠物用钢板）；术后均观察12周。通过HE组织形态学检测、x线摄片、生物力学检测等检测方法，以评估不同疗效。结果与A组相比，12周时，X线提示B组骨折线稍模糊，骨痂密度开始增加；C组则显示骨折线模糊，骨痂生长良好，骨成熟度较高；同时感染率较前两组明显降低（P＜0.01）；生物力学结果显示，与A组相比，B组、C组显示骨痂强度明显增强，但统计学没用显著差异，与A组相比生物力学均差异明显（P＜0.05）。组织形态学显示A组以纤维结缔组织为主，B组、C组则见大量骨组织形成，其中C组骨痂成熟度较高（P＜0.05）。结论EP/PRP/CS/HA复合材料具有促进骨折愈合作用，有望成为一种治疗骨缺损的良好方法。