大鼠急性肾缺血再灌注损伤早期的基因表达

林俊毅，茅幸，吴慧娟，薛爱民

（1.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032；2.复旦大学基础医学院病理学系，上海 200032）

·论著·

大鼠急性肾缺血再灌注损伤早期的基因表达

林俊毅1，茅幸2，吴慧娟2，薛爱民1

（1.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032；2.复旦大学基础医学院病理学系，上海 200032）

目的研究急性肾缺血再灌注损伤早期的差异基因表达，探索其潜在的分子机制。方法通过单纯夹闭大鼠肾动脉制备肾缺血再灌注模型，进行基因表达芯片检测和生物信息学分析，筛选急性肾损伤早期的差异基因表达及其所涉及的细胞活动和信号通路。同时，通过构建差异表达基因的生物网络来寻找与急性肾损伤关系密切的分子，并进行荧光定量PCR验证。结果在检测出的151个差异表达基因中，132个基因显著上调，19个基因显著下调，GO与KEGG通路富集分析结果显示主要与细胞增殖、细胞因子介导的信号通路和免疫反应等有关。荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，挑选出的3个与急性肾损伤高度相关的基因（ANXA1、PHLDA1、KLF6）在疾病早期具有显著的表达差异，上升倍数与芯片检测出的倍数基本一致。结论本研究揭示了急性肾损伤早期的差异基因表达特征以及所涉及的生物学过程和信号通路，其中ANXA1、PHLDA1、KLF6可能在急性肾损伤的发病机制中起到一定作用。

法医病理学；再灌注损伤；差异基因表达；生物信息学

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种高发病率、高死亡率的肾疾病，其发病因素众多。在法医临床司法鉴定实践中，常涉及创伤、休克、严重感染、药物中毒等引发AKI表现的鉴定，部分挤压综合征、心血管手术术后的伤者也有AKI的表现[1]。由于AKI的治疗效果很差，随着病程的发展，往往在住院治疗期间病情加重，导致患者出现终末期肾病甚至死亡[2]，容易引发医疗纠纷，给患者、医疗工作者和司法鉴定人员带来诸多困扰[3]。因此，探索AKI的发病机制成为当前肾病研究工作的一个重点，早期发现和早期治疗更是改善AKI预后的关键，但至目前为止，其分子机制仍不明确，尤其是早期的分子机制，有必要进行深入研究。

随着高通量基因测序技术的发展，利用基因芯片对基因表达进行检测和发现已经成为探索基因功能研究的一个重要手段[4]。基因表达芯片可以同时比较成千上万个基因的表达变化，同时利用生物信息学从海量的数据中挖掘基因之间表达变化的内在联系，可为探索疾病的发病机制进而防治疾病提供重要的线索。本研究通过构建大鼠肾缺血再灌注损伤模型，对比AKI早期与对照组基因表达的差异，运用生物信息学方法，为深入研究AKI的发病机制及探索新的治疗靶点提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及器械

健康雄性SD大鼠24只，体质量（248±5）g，由复旦大学上海医学院实验动物中心提供。微型动脉夹由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供。

1.1.2 主要试剂和仪器

麻醉所用10%水合氯醛购自美国Sigma公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。PrimeScriptTMRT试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒均购自日本TaKaRa公司。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。7500型荧光定量PCR仪购自美国AB公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与模型制作

将大鼠随机分为8组，每组3只，根据缺血再灌注时间分为3 h、6 h、12 h、24 h组以及各自对应的对照组。将大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，备皮固定，消毒手术野。

缺血再灌注大鼠沿腹中线切开皮层后，先后在结肠脾区及结肠肝区位置暴露左、右肾，用玻璃分针小心分离左、右肾动脉，然后用血管夹同时将双侧肾动脉夹闭，30 min后同时松开双侧血管夹，恢复双侧肾组织血供，观察肾组织颜色，从紫色变为红色说明经过肾缺血再灌注的病理生理过程，关腹后继续观察2h，大鼠能正常活动则说明建模成功。

对照组同法打开腹腔并找到肾动脉，但不夹闭肾动脉。

1.2.2 标本留取

根据再灌注时间的不同，分别在关腹后3、6、12、24h取其尿液，麻醉处死后取下双肾。每个样本取部分组织置于4%甲醛水溶液中固定，进行HE染色；部分组织迅速放入RNA保护液，存入液氮中，随后进行RNA抽提；余放入-80℃冰箱冻存。

1.2.3 指标的检测

尿蛋白的检测：采用考马斯亮蓝法检测尿蛋白的含量，并分别用1、5μg的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准品，运用ImageJ v1.28（美国健康协会）测量尿蛋白灰度值并统计其与3h对照组的相对表达量。

总RNA的提取：组织样本按照TRIzol法提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳判断RNA无降解，并用紫外分光光度法检测所提取RNA的浓度和纯度。RNA在波长为260 nm和280 nm处的吸光度比值（D260/D280）在1.8～2.1范围内，方可进行后续实验。

1.2.4 芯片数据处理

采用Rat lncRNA（8×60K）芯片（美国Agilent公司）及Feature Extraction v10.7.1.1软件（美国Agilent公司）处理原始图像并提取数据。接着利用GeneSpring v12.5软件（美国Agilent公司）进行数据标准化和后续处理。组织间差异基因的筛选通过t检验和差异倍数（fold-change，FC）获取而出，筛选阈值为P值≤0.01且|logFC|＞2，通过聚类分析软件Cluster v3.0（美国斯坦福大学）对差异基因进行聚类和热图制作。采用注释可视化和整合发现数据库（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID）对筛选出的差异基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析及京都基因和基因组百科库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）通路富集分析，得出差异基因转录域覆盖率。同时利用蛋白互作网络数据库STRING对差异基因进行蛋白互作分析。

1.2.5 荧光定量PCR检测

荧光定量PCR反应使用SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒在7500型荧光定量PCR仪上进行，利用蛋白互作网络数据库筛选出的3个差异显著基因［膜联蛋白A1（annexin A1，ANXA1）、血小板白细胞C激酶底物同源性样域家族A成员1（pleckstrin homology-like domain，family A，member 1，PHLDA1）和Kruppel样因子6（Kruppel-like factor 6，KLF6）］进行引物设计，其荧光定量PCR引物具体见表1。采用GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。各个基因的表达量测量均重复3次。

1.3 统计学处理

表1 荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 急性肾缺血再灌注模型的构建

HE染色显示，缺血再灌注3h组的部分肾小管中开始出现蛋白管型，并且随着再灌注时间的延长，蛋白管型逐渐增多；6h组局部肾小管上皮细胞中出现大量空泡样改变，部分上皮细胞刷状缘消失；12 h组开始出现小管上皮细胞的坏死脱落，表现为细胞核的固缩、溶解、消失以及胞质变红，部分基底膜裸露；在24h组中，小管上皮细胞坏死明显增多，间质水肿，并伴有大量的细胞管型与蛋白管型。而所有对照组的肾组织结构均表现正常，肾小球、肾小管和肾间质均未见明显病理改变（图1）。

使用凝胶电泳检测尿蛋白发现，所有对照组均未发现尿蛋白，而所有的缺血再灌注组均出现了尿蛋白（图2），与对照组相比，差异均具有统计学意义（图3）。以上结果显示，通过单纯夹闭肾动脉成功构建了急性肾缺血再灌注的大鼠模型，并表现了AKI的病理特点。

2.2 急性肾缺血再灌注早期的差异基因表达

提取肾缺血再灌注3 h组和对照组肾组织的mRNA进行基因表达芯片的检测。经基因微阵列分析3h组与其对照组的差异表达谱后发现，在检测的40 420个表达基因中，共检出151个差异表达基因，其中132个显著上调，19个显著下调，差异基因聚类和热图制作结果见图4。所有检出基因的差异表达倍数均大于2倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。差异表达基因经GO分析（表2）后发现，有10个基因富集在细胞增殖的反向调节上，且这些差异基因主要表达于细胞质中；而在分子功能的分析上，富集程度最高的是在DNA结合区。进一步经KEGG通路分析这些差异表达基因的通路后发现，涉及细胞因子与细胞因子受体相关通路的差异基因最多（表3）。

表2 GO分析结果

表3 KEGG通路分析结果

2.3 差异表达基因的验证

通过蛋白互作网络分析发现，本研究探索的3个与AKI早期病变相关的基因（ANXA1、PHLDA1和KLF6）分别与免疫、凋亡及转录关系密切，且在蛋白互作网络中均处于核心位置（图5）。荧光定量PCR验证其表达情况，结果显示，3个基因的表达均显著上升，且上升的倍数与基因芯片检测出的倍数基本一致（表4）。

表4 荧光定量PCR验证3个差异基因的mRNA相对表达量（n=3，±s）

表4 荧光定量PCR验证3个差异基因的mRNA相对表达量（n=3，±s）

注：1）与3h对照组比较，P＜0.05

组别ANXA1PHLDA1KLF6对照1.00±0.181.00±0.091.00±0.09 3h4.46±0.921）3.13±0.171）3.20±0.411）

3 讨论

AKI常发生于心血管手术后、肾移植术后以及交通事故、地震等意外事故造成肾挤压综合征后，主要由肾缺血再灌注造成，其特征为肾功能的快速下降，表现为肾小球滤过率降低、体内含氮废物积聚以及水、电解质和酸碱平衡紊乱。一旦在早期未得到及时治疗，可进展为终末期肾病，造成巨大的医学和经济负担[2]，同时也给社会、医患关系的紧张造成不良影响。

自1990年开始小鼠被引入缺血再灌注所致AKI模型的制备[5]，由于可方便制作各类转基因小鼠研究单个基因在AKI发生发展中的分子机制，其用量大大超过大鼠。然而，由于小鼠个体差异大，而且小鼠模型还受解剖结构的限制，例如在夹闭肾动脉时无法分离动静脉和输尿管，以致结果稳定性差[6]。

本研究成功构建了大鼠肾缺血再灌注损伤模型，从形态上观察到了随时间逐渐增多的蛋白管型、可能与自噬相关的小管上皮细胞内空泡形成[7]以及小管上皮细胞的坏死脱落，模型呈现了AKI的典型病理表现[8]；从功能上发现了尿蛋白的增多。为了研究AKI早期的病理生理过程及分子机制，本研究选取形态学上最先出现病理变化的3h组作为重点研究对象，即经HE染色发现缺血再灌注3h的大鼠肾小管开始出现少量的蛋白管型，提示肾小管功能开始下降。在选取3h组和对照组进行基因表达芯片检测并通过生物信息学手段进行分析后，共发现了151个差异表达基因，其中132个显著上调，19个显著下调，GO与KEGG通路富集分析结果显示主要与细胞增殖的反向调节、细胞因子介导的信号通路、免疫反应等有关。

本研究挑选了3个差异显著的基因进行实时荧光定量PCR验证，其表达差异与基因芯片的结果基本一致。与对照组相比，3h组中的ANXA1、PHLDA1和KLF6基因均呈现显著升高。其中，ANXA1所在的膜联蛋白家族是一组由钙离子调节、能够结合到带负电荷的膜磷脂上并参与一系列与钙离子相关的生物学活动的蛋白，其与炎症反应、细胞增殖和凋亡关系密切[9]。Seidel等[10]研究发现，ANXA1可抑制环氧合酶-2的形成和中性粒细胞的活性及游出，从而避免炎症因子的合成和释放。另一家族成员ANXA5已在肾缺血再灌注的研究中受到关注，其可通过阻断磷脂酰丝氨酸依赖的免疫信号传导来发挥其抗炎作用，保护肾小管细胞[11]。因此，ANXA1在肾缺血再灌注早期的升高，极有可能通过抑制环氧合酶-2，阻断免疫信号的传导来发挥其抗炎作用，进而保护缺血再灌注对肾组织造成的损伤。PHLDA1是编码血小板同源结构域的胞质蛋白，广泛参与细胞信号调节、细胞凋亡和胞内运输等生理过程[12]。Lama等[13]研究表明，PHLDA1与肾近端小管上皮细胞的凋亡相关性强；Lyu等[14]研究表明，PHLDA1的表达受到JAK2-ERK1/2-STAT3信号通路的调控。因此，PHLDA1可能通过JAK2-ERK1/2-STAT3信号通路调控肾近端小管上皮细胞的凋亡，进而引发AKI。KLF6是Kruppel家族中普遍表达的锌指转录因子，其与Kruppel样转录因子家族的其他蛋白共有一个相似的羧基端，该羧基端可与DNA结合，但KLF6还具有独特的氨基酸末端激活区、表达模式和转录靶基因，广泛参与细胞的增殖分化、凋亡及组织修复等生理过程[15]。Mallipattu等[16]研究表明，KLF6可通过保护线粒体功能，拮抗凋亡，保护足细胞免受损伤。因此，KLF6在AKI早期模型中的升高可能是通过与DNA启动子的结合、调控线粒体基因的转录等，发挥保护肾近端小管上皮细胞凋亡的作用。

早期诊断、早期诊疗是减少AKI患者病死率的关键，但目前AKI的诊断标准仍主要以血清肌酐、尿素氮等传统指标为准，无法满足临床早期诊断的需要，也给疾病分期和早期治疗带来一定的困难[17]。寻找早期的AKI标志物是实现早期诊断的基础，ANXA1、PHLDA1、KLF6三个差异基因在大鼠缺血再灌注模型早期的显著升高，给AKI的早期诊断及分期提供了有效参考指标，同时也为司法鉴定实践过程中对AKI的损伤程度鉴定、分期提供了科学探索方向。ANXA1在疾病中的抗感染作用及KLF6的抗凋亡作用也为AKI靶向性治疗研究提供新思路。

但目前对这三个基因的研究仍较为浅薄，尤其是其在急性肾缺血再灌注模型中的分子作用机制尚未明确，需要后续的深入研究才能更好地对AKI进行定义和分期，实现早期诊断和靶向治疗，这也将是今后的研究重点。

综上所述，本研究通过成功制备大鼠肾缺血再灌注损伤模型进行基因表达芯片检测和生物信息学分析差异基因，发现了一系列差异基因以及所涉及的生物学过程和信号通路，为寻找AKI早期的分子靶点、进一步研究AKI早期的发病机制以及探索新的治疗靶点提供了方向。同时也为法医在司法鉴定工作中针对AKI的损伤鉴定分期及预后评估提供了新的思路。

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Genes Expression in the Early Stage of Acute Renal Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LIN Jun-yi1,MAO Xing2,WU Hui-juan2,XUE Ai-min1
（1.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032, China;2.Department of Pathology,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032, China）

ObjectiveTo study the differential genes expression in the early stage of acute renal ischemiareperfusion injury and explore potential molecular mechanisms.MethodsThe ischemia-reperfusion model was made via clamping renal artery of rat.The microarray detection and bioinformatics analyzing of the genes expression were performed.Differentially expressed genes were screened and related cellular activities and signaling pathways were analyzed in early stage of acute kidney injury.Meanwhile,molecules closely relative to acute kidney injury were explored by establishing a biological network of the differentially expressed genes,and the results were verified by real-time PCR.ResultsA total of 151 genes showed differential expression in this study,including 132 up-regulated and 19 down-regulated genes. Cell proliferation,cytokines mediated signaling transduction and immune responses were greatly enriched by GO and KEGG analysis.The results of real-time PCR showed that compared with control groups, three selected genes（ANXA1,PHLDA1 and KLF6）which related to the acute kidney injury had an obvious differential expression in the early stage of disease.The multiple of increase was essentially the same as the multiple detected by microarray.ConclusionThis study shows differential gene expression profile,related biological processes and signaling pathways involved in the early stage of acute kidney injury.ANXA1,PHLDA1 and KLF6 may play a role in the pathogenesis of acute kidney injury.

forensic pathology;reperfusion injury;differential gene expression;bioinformatics

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.001

1004-5619（2016）06-0401-05

2015-12-21）

（本文编辑：邹冬华）

上海市科委科创项目（15140902900）

林俊毅（1989—），男，博士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：13111010032@fudan.edu.cn

薛爱民，男，副主任法医师，主要从事法医病理学研究；E-mail：amxue@fudan.edu.cn

通信作者：吴慧娟，女，讲师，主要从事病理学研究；E-mail：hjwu@shmu.edu.cn