规范检测技术控制发病率—《裂头绦虫幼虫检测》标准解读

随着人民生活水平的不断提高，食物来源、饮食方式和饮食习惯的多样化，因食源性寄生虫造成的食品安全问题亦越来越突出，由此引发的食源性寄生虫病发病人数及发病率大幅度增加。近年来，随着生食和半生食方式的引入和推广,使得食源性寄生虫的感染率猛增，海洋、淡水鱼类（包括深海鱼、浅海鱼、淡水回游鱼、蛙）等水产品的摄入量也较以往大大增加，特别是三文鱼、鳟鱼、金枪鱼、马哈鱼、蛙类等一些水产品的市场占有率大大提升，使裂头绦虫病、异尖线虫病等寄生虫病的发病率逐年升高，据文献回顾，我国20世纪50年代以来报道因生食海鱼而感染阔节裂头绦虫病12例，主要来自黑龙江省，其中，台湾省报道2例。近两年，大量的三文鱼、金枪鱼、鳟鱼等深海鱼投放市场，在上海出现了多例阔节裂头绦虫感染患者；自2000年以来，因生吃或半生吃蛙、蛇肉和蛇胆等感染的曼氏裂头蚴的病例达104例，由此看出，鱼类、蛙类等水产品中的裂头蚴感染的情况日益严重，但我国至今也没有关于水产品中裂头绦虫幼虫的检测标准，这给食品安全问题敲响了警钟。因此，规范水产品中寄生虫幼虫的检测标准十分必要，此标准的实施可为相关水产品生产企业提供安全质量控制标准，为疾病控制和检测机构提供检测规范。

1 标准编制过程与方法

受国家卫生和计划生育委员会政策法规司委托，由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、上海出入境检验检疫局和上海市疾病预防控制中心有关专家组成标准编制工作组。编写组通过查阅科技文献及有关文库，收集国内外有关裂头绦虫幼虫（裂头蚴）检测方法方面的最新研究资料，并进行分析和整理；首先对目前国内外检查裂头蚴最常用的压片法和消化法进行评估和规范；接着，根据基因库中报告的裂头属绦虫幼虫的基因序列保守片段，参考国内外相关研究资料[1-6]，选择可用于裂头属绦虫幼虫扩增的特异性引物，同时用国内采集的裂头属绦虫幼虫、裂头属绦虫成虫，并同时以迭宫属绦虫幼虫作为对比研究，对PCR方法进行了验证，确定引物和体系的适用性。在此基础上按照我国有关标准制修订的要求和规范，起草了《裂头绦虫幼虫检测技术》征求意见稿。2015年11月11日，第七届国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会24位专家对此标准进行了评审，修改完成了《裂头绦虫幼虫检测技术》送审稿。

在此基础上，采用专家咨询法广泛征求全国各有关医疗机构、疾控机构、医学院校、科研院所、检验检疫机构等单位有关知名专家学者意见，对反馈意见进行讨论、斟酌。并修改相应内容，完成上报稿通过国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会会审，认为该标准符合科学性、实用性、完整性和准确性等制标要求，上报国家卫生计生委卫生和计划生育监督中心审核，并在国家卫生标准网公示，广泛征集意见和建议。

2017年国家卫生和计划生育委员会发布通告（国卫通[2017]11号）公告《裂头绦虫幼虫检测技术》（WS/T571-2017）卫生行业标准将于2018年2月1日起施行。这个标准填补了鱼类、蛙类等水产品中的裂头蚴检测标准的空白，为相关水产品生产企业提供安全质量控制标准，为疾病控制和检测机构提供检测规范，从源头上控制了裂头蚴病的感染，保障了人民的身体健康。

2 标准正文内容

本标准规定了裂头绦虫幼虫检测技术的操作流程，主要涉及样本种类、样本采集、裂头蚴形态学检测方法、裂头蚴分子生物学检测方法、形态学鉴定结果的判定、PCR结果的判定、检测需要试剂的配制等内容。

2.1 适用范围

根据裂头绦虫幼虫形态、寄生特点和生活史情况，明确规定了本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检测。

2.2 规范性引用文件

2.3 术语和定义

明确了裂头蚴、曼氏裂头蚴、阔节裂头蚴的定义并作出解释。

2.3.1 裂头蚴（plerocercoid larvae）指裂头绦虫的幼虫，是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼虫的总称。

2.3.2 阔节裂头蚴（plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或phyllobothrium latum）指寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫。

2.3.3 曼氏裂头蚴（lerocercoid larvae of Spirometra mansoni）指寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。

2.4 仪器器材

规定了裂头蚴幼虫检测过程中所有需要的仪器和实验器材明细。体视显微镜和生物显微镜用于裂头蚴的形态学鉴定；PCR扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪用于核酸鉴定实验的必用仪器设备；超净工作台是保证实验结果正确性的必须的实验环境；离心机和解剖手术器械是整个实验用到的器材和设备。

2.5 试剂材料

对裂头蚴幼虫检测过程中所有涉及的试剂、引物及阳性对照进行了规定，保证实验结果的正确性。包括了胃蛋白酶消化液、扩增裂头蚴核糖体DNA转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素C氧化酶（Cox1）引物序列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列；阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组DNA。

2.6 检测步骤

此为整个标准的核心。标准规定了样品准备、检测具体操作步骤，介绍了压片检查法、蛋白酶消化法和核酸检测法的详细操作步骤，在核酸检测法中细化规定了取样的方法、核酸的提取、PCR反应程序，详细阐明了裂头蚴的形态特征及结果判断。

2.6.1 压片检查法 用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条/只进行解剖。取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物的组织用载玻片压片，用生物显微镜镜检判定结果。

2.6.2 蛋白酶消化法 称取样品250 g并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液1：5 的比例加入消化液，37℃消化至无肉眼可见的肉组织为止。消化后用0.8 mm×0.8 mm（10目）网筛过滤，滤液置于尖底量筒内，加水（用水参照 GB/T 66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿，用体视显微镜镜检判定结果。

2.6.3 核酸检测法 首先对取样进行了详细规定，第一步，在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用。第二步，按照总体积25 μl, 模板 DNA2 μl，上下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μl，dNTPs 2 μl，MgCl22.5 μl，10× 缓冲液 2.5 μl，Taq 酶 （5 U/μl） 0.2 μl，补 充ddH2O至25 μl的反应体系，第三步，按照94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min ，35个循环；72℃延伸7 min的PCR反应程序，第四步，进行电泳取10 μl产物与2 μl的6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中。在1×TAE缓冲液中，3～4 V/cm电泳约30 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。

2.6.4 结果判定 （1）裂头属的裂头蚴判定 若从鱼体内检出的幼虫大小长 2～20 mm，宽 2～3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，可初步判定裂头属的裂头蚴。（2）迭宫属的裂头蚴形态判定 若从蛙或蛇体内检出的幼虫大小长 0.5～80 cm，宽 0.3～1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶，可初步判定为迭宫属的裂头蚴。（3）核酸扩增结果判定目的基因扩增片段出现条带而空白对照未出现条带，实验结果成立；阔节裂头蚴特异引物扩增，出现428 bp的特征条带，初步判定该虫种为阔节裂头蚴；曼氏裂头蚴特异引物扩增，出现156 bp的特征条带，初步判定该虫种为曼氏裂头蚴；若要进一步对幼虫定种，需将引物扩增产物进行测序，将其序列与GenBank上序列进行比对后定种。

3 标准附录内容

标准有2个资料性附录（A、C）和一个规范性附录（B）组成。

3.1 附录 A

附录A 为关于裂头蚴的病原学资料，主要介绍了阔节裂头蚴和曼氏裂头蚴的形态特征，阐述了阔节裂头绦虫和曼氏迭宫绦虫的生活史[1]。

3.2 附录 B

附录B 为与检测相关的技术方法的技术性资料，主要把检测相关的试剂配制、裂头绦虫引物的模板、DNA的提取方法及相关试剂代码的解释，都细化列出，保证检测过程的完整、正确、有效。

3.3 附录 C

附录C 为资料性附录，附上了在鱼肉中阔节裂头蚴的彩色图片，及来自蛙、蛇体中取出的曼氏裂头蚴的图片，以方便检测人员在检测过程中的比对辨认。

4 标准实施和宣贯重点

近年来，各种海产品大量投放市场，食用生鱼片人数剧增，食用生三文鱼、鳟鱼等海鱼感染裂头绦虫的人数也逐年增多。饮食习惯的改变，使得人们食用食品的种类百花齐放，凉拌蛇皮、快炒蛙肉等，也造成了曼氏裂头蚴病剧增。如何从源头上杜绝或减少裂头蚴病的发生，《裂头绦虫幼虫检测》标准为检验检疫、食品检测机构提供了标准的检测方法，保证水产品的安全。在标准实施和宣贯中要注意几个重点：一是加强对裂头蚴感染率高的国家周围海域进口的海鱼的检验检疫，如，日本；以及对在海鱼洄游产卵的江河捕获的鱼加强检测，如，我国东北松花江的鳟鱼；二是严管市场捕获的野生蛙、蛇在市场的流放，加强农业部门检测机构对这些两栖类动物的检疫；三是加强检验检疫部门及食品加工企业的宣传与培训，使之能及时发现检出裂头蚴；四是加强人群的健康教育，不生吃或半生食鱼类、蛙等水产品，改变不良的饮食习惯，提高自我保护意识。五是加强疾控医疗机构的宣传培训，及时发现患者，及时得到治疗。