复合微生物固态发酵整粒菜籽的研究

刘倚帆， 王星凌， 岳寿松，钱 鑫， 万发春*， 赵红波， 刘晓牧

（1.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100；3.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东济南250100；4.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018）

资源开发利用

复合微生物固态发酵整粒菜籽的研究

刘倚帆1，2， 王星凌1，2， 岳寿松3，钱 鑫1，4， 万发春1，2*， 赵红波1，2， 刘晓牧1，2

（1.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100；3.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东济南250100；4.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018）

为研究复合微生物固态发酵对整粒菜籽霉变、营养成分、氨基酸组成等的影响，利用米曲霉和酵母菌对整粒菜籽进行固态有氧发酵，利用乳酸菌和酵母菌进行厌氧发酵，然后在发酵第7、14、21、28天测定发酵产物霉变比例、pH值、常规营养成分以及氨基酸组成。结果表明：米曲霉和酵母菌固态有氧发酵菜籽在发酵期间霉变比例显著降低。发酵第7天，发酵组粗蛋白质、粗脂肪、钙含量比对照组分别提高了7.89%、3.76%、20.45%，且比发酵前提高了6.59%、6.34%、15.22%，能量也比发酵前提高了19.82%，必需氨基酸及总氨基酸含量比对照组分别提高了12.89%、7.72%，比发酵前分别提高了13.80%、9.28%。乳酸菌和酵母菌复合固态厌氧发酵菜籽在发酵期间有效降低霉变比例和pH值，发酵组干物质、粗蛋白质、粗脂肪比发酵前提高了1.86%、8.69%、10.96%。酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维比对照组分别降低了4.59%、6.99%，发酵组必需氨基酸及总氨基酸含量比对照组分别提高了11.68%、8.72%，且比发酵前提高了12.58%、10.13%。由此可知，米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒菜籽及乳酸菌和酵母菌复合固态厌氧发酵整粒菜籽随着发酵时间的延长均能通过降低霉变比例，提高粗蛋白质、粗脂肪等营养成分含量，提高必需氨基酸及总氨基酸含量，达到保存饲料及改善饲料品质的目的。

米曲霉；酵母菌；乳酸菌；菜籽；发酵

菜籽含油率高达35%～45%，蛋白质含量高达36%～38%，其营养价值与豆粕相近，是良好的精饲料，被广泛应用于养殖业 （李建凡等，1995）。张杰杰（2014、2013）研究表明，饲粮中添加不同水平的油菜籽对牛瘤胃发酵参数无显著影响，但添加17.6%的油菜籽能显著提高肉牛生产性能和肉品质。由于菜籽自身含有有毒有害物质如硫代葡萄糖苷，以及纤维素、低聚糖等抗营养因子，且蛋白质品质较差，蛋氨酸等必需氨基酸含量低且不平衡等限制了其在饲料中的应用。而目前通过微生物发酵方法脱毒及提高饲用品质的报道多数针对菜籽粕，而对整粒菜籽发酵鲜见报道。因此，本试验旨在研究整粒菜籽经微生物有氧或厌氧发酵后营养成分、pH、氨基酸含量的变化，观察和评估菜籽的发酵效果和营养价值，从而为菜籽在反刍动物饲料中的应用提供有效的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料 整粒菜籽：市售。米曲霉（含5亿孢子粉）、马克思克鲁维酵母菌以及乳酸菌（嗜酸乳酸菌和粪肠球杆菌按1∶1混合）均由某实验室提供。

1.2 试验设计 菜籽有氧发酵采用固态发酵的方式，米曲霉和酵母菌分别以0.8%和0.2%的接种量接种于7 kg菜籽中，水分含量为30%，发酵温度为30℃；菜籽厌氧发酵采用固态发酵的方式，乳酸菌和酵母菌分别以0.8%和0.2%的接种量接种于7 kg菜籽中，水分含量为30%，厌氧发酵温度为35℃，在第7、14、21、28天取样，一份65℃烘干测定初水分，用于常规饲料成分检测；一份-20℃保存用于鲜样测定。具体试验设计见表1。

表1 菜籽发酵试验设计

1.3 试验方法

1.3.1 菜籽形态、气味及霉变比例测定 每次取样前先观察记录菜籽的形态及挥发出的气味，并测定霉变比例。

1.3.2 pH测定 在规定取样时间，选取对照组和发酵组样品各10 g，加蒸馏水90mL，于摇床上100 r/min振荡30min，使用pH计测定其pH。

1.3.3 常规营养成分测定

干物质 （DM）：采用失重法测定；粗蛋白质（CP）：采用凯氏定氮法测定；粗脂肪（EE）：采用残余法测定；有机物（OM）：灰化法测定；能量（GE）：采用氧弹热量计法测定；Ca、P：原子吸收光谱法测定；酸性洗涤纤维 （ADF）：采用NY/T 1459-2007测定；中性洗涤纤维 （NDF）：采用GB/T 20806-2006测定。

1.3.4 氨基酸组成的测定 参考GB/T 18246-2000，采用氨基酸自动分析仪测定。

2 试验结果

2.1 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽霉变比例、pH、营养成分、氨基酸组成的影响

2.1.1 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽霉变比例的影响 由表2可知，与对照组相比，米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵能有效降低整粒菜籽在发酵过程中的霉变产生。

表2 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽霉变比例的影响%

2.1.2 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽pH的影响 由表3可知，发酵组pH呈现先降低后升高的趋势，而对照组pH则持续下降。发酵第21天开始，发酵组pH显著高于对照组，与发酵前相比，差异不显著。

表3 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽pH的影响

2.1.3 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽营养成分的影响 由表4可知，米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵整粒菜籽第7天，粗蛋白质、粗脂肪、钙含量比对照组分别提高了7.89%、3.76%、20.45%，且比发酵前提高了 6.59%、6.34%、15.22%，能量也比发酵前提高了19.82%。随着发酵时间的延长，粗蛋白质、钙、磷含量升高，干物质、粗脂肪、ADF和NDF含量先升高后降低。

2.2.4 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽氨基酸组成的影响 由表5可知，米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵整粒菜籽第7天，发酵组必需氨基酸及总氨基酸含量比对照组分别提高了12.89%、7.72%，比发酵前分别提高了13.80%、9.28%。其中，蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸分别提高了59.38%、16%、11.66%、20.43%。但随着发酵时间的延长，必需氨基酸及总氨基酸含量逐渐降低。

表4 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽营养成分的影响

表5 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽氨基酸组成的影响 g/100 g

2.2 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽霉变比例、pH、营养成分、氨基酸组成的影响

2.2.1 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽霉变比例的影响 由表6可知，与对照组相比，乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵能有效降低整粒菜籽在发酵过程中的霉变产生。

2.2.2 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽pH的影响 由表7可知，随着发酵时间的延长，对照组和发酵组的pH明显下降，对照组在发酵第7天变化迅速，pH值从6.97降到5.87，而发酵组下降缓慢，但在发酵14 d后，发酵组pH下降迅速，到发酵28 d，pH降到4.83。

2.2.3 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽营养成分的影响 由表8可知，乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵整粒菜籽第14天，营养成分如干物质、粗蛋白质、粗脂肪比对照组略有提高，但比发酵前提高了1.86%、8.69%、10.96%。ADF 和NDF比对照组分别降低了4.59%、6.99%。随着发酵时间的延长，干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙、磷含量逐渐降低。

表7 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽pH的影响

2.3.4 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽氨基酸组成的影响 由表9可知，乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵整粒菜籽第14天，发酵组必需氨基酸及总氨基酸含量比对照组分别提高了11.68%、8.72%，且比发酵前提高了12.58%、10.13%。其中，蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸含量比对照组分别提高了 40%、11.7%、15.32%、10.12%、16.84%，且比发酵前分别提高了36.11%、6.06%、14.4%、13.5%、19.35%。但随着发酵时间的延长，必需氨基酸及总氨基酸含量逐渐降低。

表8 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽营养成分的影响

表9 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽氨基酸组成的影响 g/100 g

3 讨论

3.1 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒菜籽霉变比例、pH、营养成分、氨基酸组成的影响本试验采取复合菌种发酵模式，分别利用米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵及乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵方式对整粒菜籽进行发酵。菌种是微生物发酵取得良好效果的关键，原料经发酵后气味芳香、适口性好，并且发酵过程中可产生多种水解酶，富含B族维生素等。黑曲霉、米曲霉、根霉、木霉等霉菌可以分泌丰富的酶类，如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等，这些酶能够促进原料中的淀粉、纤维素等高分子化合物分解为单糖，供微生物生长需要；且菌体中蛋白质含量也较高，达到20%～30%，因此，在蛋白质饲料的生产中这些种类霉菌得到广泛应用。pH是发酵工艺中的一个重要因素，不同的微生物都有一个适宜其生长和发挥活性功能的最适pH范围。一般情况下，真菌生长的pH范围为3.5～6.0，酵母菌为4.5～7.0（吴伟伟，2009）。本试验在发酵第一周（7 d内），对照组和发酵组pH均在正常范围内，而到发酵第28天，发酵组pH值为7.49，高于米曲霉和酵母菌最适生长pH范围，这也可能是导致发酵后期霉菌大量繁殖的原因。

固态发酵改善发酵底物营养价值，降低抗营养因子含量，主要是由于微生物产生功能性酶的作用。付敏等（2013）研究发现，随着发酵时间的延长，有效氮、小肽和游离氨基酸含量都呈线性增加，而硫苷和纤维类物质呈线性降低。到发酵后期，小肽和游离氨基酸含量变化趋于稳定，菌落进入衰亡期，次级代谢产物分泌增加，培养基温度升高，蛋白酶产量降低导致小肽和游离氨基酸含量增加速度变慢。一般来说，霉菌的最佳培养时间较细菌长，达到产酶高峰期的时间也较长。胡永娜等（2012）选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、啤酒酵母、毕赤酵母及黑曲霉对菜籽粕进行单菌或复合菌株发酵，结果表明，复合菌株发酵效果明显优于单菌株发酵，以枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和啤酒酵母三种菌种组合发酵效果最好，粗蛋白质含量增加5.37%，并有效降低硫苷、单宁等抗营养因子的含量。本试验中，米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵整粒菜籽第7天，营养成分如粗蛋白质、粗脂肪、钙、磷含量均高于对照组，且高于发酵前菜籽。随着发酵时间的延长，粗蛋白质、钙、磷含量逐渐升高，但干物质、粗脂肪、ADF和NDF含量逐渐降低。在发酵第7天，发酵组必需氨基酸及总氨基酸含量达到最高值，不仅高于对照组氨基酸含量，且高于发酵前菜籽氨基酸含量。但随着发酵时间的延长，必需氨基酸及总氨基酸含量逐渐降低。表明发酵后菜籽的蛋白质品质得到显著提高，发酵后氨基酸含量发生变化，主要与微生物复杂的分解合成代谢过程有关，由于发酵后微生物菌体蛋白中蛋氨酸含量较高，所以使发酵后棉籽的蛋氨酸含量也提高了近60%，但具体机理还需要进一步研究。

3.2 乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵对整粒菜籽霉变比例、pH、营养成分、氨基酸组成的影响在对菜籽进行有氧发酵的同时，利用乳酸菌对其进行了厌氧发酵研究，以探讨利于整粒菜籽发酵的最佳模式。植物蛋白质的结构大都十分紧密，分子质量较大，不易消化吸收，吸收率往往低于动物蛋白质。乳酸菌在发酵过程中，需要利用底物中的营养物质来满足其能量需要和生长繁殖，底物中碳水化合物是乳酸菌生长繁殖所需能量的主要供应者，同时也为微生物蛋白质、脂肪和核酸等大分子物质的合成提供碳源。与此同时，在乳酸菌发酵过程中产生的酶类能降解底物中纤维素、半纤维素、淀粉和果胶等大分子物质（孙宏，2009）。因此，植物蛋白原料经微生物发酵后，其蛋白质绝对含量不变或略有下降，但由于碳水化合物的降解导致粗蛋白质相对含量上升。

乳酸菌在发酵过程中会产生乳酸、乙酸、丙酸和细菌素等多种物质，这些物质除具有抑菌作用外，还对维持肠道内微生物平衡、抑制病原菌生长、调节胃肠道功能等具有一定的作用。同时，饲料经乳酸菌发酵后，有特殊的酸甜芳香气味，pH下降，能有效改善饲料的适口性。魏炳栋等（2014）利用乳酸菌和酸性蛋白酶为发酵剂，对豆粕、棉籽粕和菜籽粕进行固态厌氧发酵，结果表明，能有效提高粗蛋白质含量，降低pH，并能有效降解棉籽粕和菜籽粕中的抗营养因子，改善饲料品质。孙林等（2009）利用植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌对菜籽粕进行单菌和混菌固态发酵，结果表明，混菌发酵效果优于单菌发酵，发酵48 h后粗蛋白质含量提高4.37%。王刚等（2011）利用酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌对菜籽粕进行固态发酵，使粗蛋白质含量从39.99%提高到45.85%，氨基酸的组成和含量也有一定的变化和提高。本试验利用乳酸菌、酵母菌混合固态厌氧发酵整粒菜籽，在发酵第14天，营养成分如干物质、粗蛋白质、粗脂肪、钙、磷和能量高于发酵前，ADF和NDF低于发酵前菜籽。发酵组必需氨基酸及总氨基酸含量高于对照组，且高于发酵前棉籽氨基酸含量。但随着发酵时间的延长，干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙、磷含量逐渐降低，必需氨基酸及总氨基酸含量也逐渐降低。

近年来，越来越多的研究报道了益生菌菌体或其代谢产物可以降解黄曲霉毒素。Nagendra等（1999）研究表明，乳酸菌对黄曲霉毒素B1的去除能力在20%～50%，主要是通过吸附黄曲霉毒素来发挥作用。王涛（2010）在对发酵豆制品中黄曲霉毒素控制的研究中，通过利用植物乳杆菌与米曲霉互补和协同作用，有效控制了由于杂菌污染而产生的黄曲霉毒素。本试验中，不论是对照组还是发酵组均未检测出黄曲霉毒素B1，这可能与菜籽本身的结构与特征有关，乳酸菌对控制黄曲霉毒素的产生还需要进一步的研究。

4 结论

4.1 米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒菜籽，以及乳酸菌和酵母菌复合固态厌氧发酵整粒菜籽，能够提高植物性蛋白质饲料中粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙等营养物质的含量，并提高必需氨基酸及总氨基酸含量，从而改善饲料品质，提高营养价值。

4.2 米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒菜籽，以及乳酸菌和酵母菌复合固态厌氧发酵整粒菜籽，能有效降低发酵过程中植物性蛋白质饲料的霉变比例，延长饲料保存期限。

4.3 米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒菜籽的最佳时间为7 d，接种量为1%，含水量30%，发酵温度30℃；乳酸菌和酵母菌复合固态厌氧发酵整粒菜籽的最佳时间为14 d，接种量为1%，含水量30%，发酵温度35℃。

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This experiment was conducted to investigate the effect of solid-state aerobic and anaerobic fermentation of whole rapeseed with Aspergillus oryzae，Kluyveromyces marxianus and lactobacillus on mouldy proportion，pH，nutrients，amino acid concentration.The results showed that using solid-state aerobic fermentation with Aspergillus oryzae and Kluyveromyces marxianus，the mouldy proportion of whole rapeseed was decreased during whole course，crude protein （CP），ether extract（EE），calcium，essential amino acid and total amino acid were increased and acid detergent fiber （ADF）and neutral detergent fiber（NDF）were decreased at 7 d，compared with the control group.Ussing solid-state aerobic fermentation with Lactobacillus and Kluyveromycesmarxianus，themouldy proportion and pH of whole rapeseed were decreased during whole course，CP，EE，calcium，essential amino acid and total amino acid were increased，while ADF and NDF decreased at 14 d，compared with control group.The results indicated that the feeding velue of whole rapeseed were greatly improved after fermentation.

Aspergillus oryzae；Saccharomycete；Lactobacillus；rapeseed；fermentation

S816.6

A

1004-3314（2017）01-0036-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170108

现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项资金 （CARS-38）；“十二五” 国家科技支撑计划（2012BAD39B05-02）；山东省现代农业产业技术体系创新团队建设项目（SDAIT-09-07）

*通讯作者