草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

梁健嘉张琼宇李 恒郑建波罗 琛

(1. 浙江大学生命科学学院, 杭州 310058; 2. 永州职业技术学院基础医学部, 永州 425100)

草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

梁健嘉1张琼宇2李 恒1郑建波1罗 琛1

(1. 浙江大学生命科学学院, 杭州 310058; 2. 永州职业技术学院基础医学部, 永州 425100)

为研究CADMs(Cell adhesion molecules)在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中发挥的作用, 用RTPCR和RACE方法结合测序分析, 在草鱼脑组织中检测到了该基因家族成员cadm2b基因的4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5′端的序列完全相同, 在3′端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此, 可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b 的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全长1669 bp, 开放阅读框(ORF)1203 bp,编码400个氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全长2783 bp, 开放阅读框长1323 bp, 编码440个氨基酸; cadm2bX3的cDNA序列全长2755 bp, 开放阅读框1296 bp, 编码431个氨基酸; cadm2bX6基因的cDNA序列全长2649 bp, 开放阅读框1161 bp, 编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区, 但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点, CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点, 而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达, 在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞, 而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞黏附因子, 可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。

草鱼; cadm2b; 基因克隆; 组织表达

CDMAs (Cell adhesion molecules)属于脊椎动物细胞黏附分子(CAMs)家族中免疫球蛋白超家族的成员, 是单次跨膜糖蛋白, 其氮端(胞外区)的3个连续Ig结构域以亲同性(Homophilic)或亲异性(Heterophilic)相互作用[1]起稳定细胞间黏附的作用, 并以单次跨膜结构域与胞浆区结构相连接; 其羧基端(胞浆区)具有的近膜4.1蛋白[2]结合位点和蛋白末端Ⅱ型PDZ蛋白[3]结合位点, 参与了维持细胞极性和介导细胞信号传导的过程[4,5]。已有研究表明CADMs是一种多功能的细胞黏附因子, 在精子发生[6—10]、上皮发育与稳态维持[11]、中枢神经系统发育[12—14]以及抑制众多肿瘤发生[15—17]等过程中都起重要作用。此外, CDMAs是介导免疫肥大细胞与靶细胞识别和结合的关键受体, 对免疫肥大细胞行驶抵御病害感染的功能, 构建有机体抵御病害感染的第一道防线至关重要[3,18—21]。

该蛋白家族的第一个基因cadm1于2002年由Thomas Biederer[16]等首次在成年小鼠前脑中克隆。目前已知在人与小鼠的基因组中有cadm1、2、3、4四个基因[16,22,23,18], 在鸡基因组中有cadm1、cadm2、cadm3三个基因[24], 而斑马鱼由于基因组的加倍和基因分化, 在其基因组中有cadm1a、1b、2a、2b、3、4共6个同源基因[25]。除了有不同的同源基因外, 哺乳动物cadm1还通过在转录后对mRNA前体(pre-mRNA)的不同选择性剪接而产生不同的mRNA剪接变体(Splice variant)[26]。已经证明由不同的剪接变体所产生的CAMD1蛋白质异构体(Isoforms)调控免疫肥大细胞的不同功能[27,28]。生物信息学预测表明cadm2b可能也存在多种不同的转录剪接体, 但尚无有关克隆和功能研究的报道。为研究CADMs是否在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中起作用, 我们选择克隆了草鱼cadm2b的mRNA, 发现了该基因的4个不同转录剪接体, 分析了该基因在成体草鱼不同组织中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所使用的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为2龄的草鱼, 购自杭州城北商贸园菜市场。适量的草鱼脑、肝、肾、鳃、胰、心、肌肉、尾鳍组织样品经液氮冷冻后保存于-80℃, 用于后续RNA和基因组DNA提取。

1.2 实验方法

草鱼基因组DNA、Total RNA的提取和cDNA第一链的获得草鱼的基因组DNA使用酚氯仿法从尾鳍组织中提取。草鱼脑、肝脏、鳃、肾脏、胰脏、心脏、肌肉组织的Total RNA的获取依据Total RNA Extractor (Trizol)(生工生物工程股份有限公司)试剂盒操作步骤进行, 随后使用TURBO DNA free kit(ambion)试剂盒对所提取的总RNA进行消化处理, 清除基因组DNA污染。消化后的总RNA溶解于无核酸酶水中并于-80℃冰箱中冷冻保存。以成年草鱼各组织纯化后的Total RNA为模板,使用Reverse Transcription System(Promega)逆转录合成cDNA第一条链, 实验过程依据试剂盒说明书完成。以草鱼脑组织总RNA为模板, 使用Clon-Tech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification的试剂盒分别合成5′RACE和3′RACE相应的cDNA文库, 具体操作按试剂盒说明书进行。

草鱼全长cadm2b cDNA的克隆根据斑马鱼中cadm2b基因序列设计跨编码区引物cadm2b-S1、cadm2b-AS1 (表 1), 以成年草鱼脑组织RNA逆转录获得的cDNA为模板进行扩增, 并对所获得的片段进行胶回收和测序。测序的结果使用NCBI网站中Blast功能进行序列分析, 确定其为草鱼cadm2b cDNA序列后, 再依据这一序列设计上游、下游的特异性嵌套引物, 使用RACE法扩增草鱼cadm2b基因的5′和3′末端序列。

cadm2b基因的5′和3′RACE cDNA第一链的合成, 依据SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)扩增试剂盒说明书进行。随后, 以新合成的RACE cDNA为模板, 使用设计的特异性嵌套引物cadm2b-5′RACE AS1、cadm2b-3′RACE S1等(表 1)配合SMARTerTMRACE试剂盒所提供的通用引物UPM(Universal Primer A Mix. Long (0.4 μmol/ L): 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCA GTGGTATCAACGCAGAGT-3′; Short (2 μmol/L): 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′与NUP (Nested Universal Primer A. 10 μmol/L: 5′-AAGC AGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)使用Premix Extaq酶进行巢式PCR实验, 扩增cadm2b基因的5′端和3′端cDNA序列。RACE实验PCR循环参数如下:第一轮, 5′RACE实验使用引物5′RACE AS1与UPM进行实验; 3′RACE实验使用引物3′RACE S1与UPM进行实验。所使用的循环参数为: 95℃ 5min, 95℃ 5s, 65℃ 30s, 72℃ 2min (10个循环); 95℃ 5s, 62℃ 30s, 72℃ 2min (22个循环), 72℃ 10min。第二轮, 5′RACE实验使用引物5′RACE AS2与NUP进行实验; 3′RACE实验使用引物3′RACE S2与NUP进行实验。所使用的循环参数为: 95℃ 5min, 95℃ 5s, 64℃ 30s, 72℃ 2min (10个循环); 95℃ 5s, 62℃ 30s, 72℃ 2min (22个循环), 72℃ 10min。将获得的5′和3′UTR片段凝胶回收后进行测序, 再根据所得序列设计与5′和3′UTR匹配的引物, 通过RT-PCR进行全长cDNA的合成和连锁分析。

草鱼cadm2b cDNA蛋白质序列预测及系统进化分析使用Primer Premier 5软件预测cadm2b基因编码的蛋白质的氨基酸序列, 将预测的结果分别与其他物种进行同源性分析, 使用MEGA5.1软件的Neighbor-joining方法构建进化树。依据软件预测的氨基酸序列使用NCBI和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)预测CADM2b蛋白的结构, 最后利用Adobe Illustrator CC2015软件绘制核酸结构与蛋白结构简图。

表 1 用于草鱼cadm2b cDNA克隆的引物Tab. 1 Primers used in cloning the cDNA of cadm2b

cadm2b在草鱼成体不同组织和器官中表达分析取成年草鱼中各组织1 μg Total RNA样品,按前述方法经逆转录合成cDNA的第一链。半定量PCR实验所使用的跨内含子引物参考斑马鱼cadm2b基因内含子结构位置设计。其序列为KN4 S: 5′-TC GTGGAAGGAGCTGACCAT-3′; KN4 AS: 5′-GAG GCCTGTGATTTCTGGTTTT-3′, 实验循环条件为95℃5min; 95℃30s, 57℃30s, 72℃30s (30个循环); 72℃ 10min。使用β-actin基因作为内参基因, 使用的引物为GrassF β-actin S: 5′-TCACACCTTCTAC AACGAGCTGCG-3′, GrassF β-actin AS: 5′-GAA GCTGTAGCCTCTCTCGGTCAG-3′, PCR循环条件为: 95℃ 5min; 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s, 30个循环; 72℃ 10min。当不存在基因组污染时, 条带大小为330 bp, 而存在基因组污染时条带大小为651 bp。为检测在不同组织中cadm2b的微量表达, 在上述半定量引物的内侧设计了巢式PCR引物。其序列为KN4巢S1: 5′-ATCAGTGATGTTACTCTGTC AGATG -3′KN4巢AS1: 5′-TGATTTCTGGTTTT GCTGGAACG-3′。实验循环条件为95℃ 5min; 95℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 20s (30个循环); 72℃10min。

荧光定量RT-PCR实验使用TaKaRa公司的Prime ScriptTMRT reagent Kit对不同组织的mRNA进行逆转录。各不同组织所用的总RNA量均为为250 ng。用SYBR Premix Ex Taq试剂盒, 在LightCycler 480 System上进行荧光定量分析。反应条件为: 95℃30s; 95℃ 5s, 62℃ 30s (40个循环)。为保证结果的可靠性, 对每一样品的分析都重复了3次。所获得的CT值使用2-ΔΔCt法对数据进行处理。

2 结果

2.1 草鱼cadm2b cDNA结构及预测的氨基酸序列

用引物cadm2b-S1、cadm2b-AS1通过RT-PCR方法在成年草鱼脑组织RNA中扩增到了一段长约1.2 kb的序列。对该序列进行测序和使用NCBI网站中Blast功能进行序列分析的结果表明其与斑马鱼cadm2b序列高度同源, 故可以确定其为草鱼cadm 2b cDNA序列。随后使用与该序列匹配的上下、游特异性嵌套引物, 通过RACE法扩增草鱼cadm2b基因的5′和3′末端序列, 分别获得了长度为238 bp的5′-UTR产物, 以及长度分别为228 bp和1.4 kb的3′UTR产物(图 1A)。在通过测序获得这些RACE产物的序列后, 分别设计了与5′UTR和两条不同3′RACE产物序列匹配的引物。然后用其进行了RT-PCR全长序列克隆和连锁分析(表 1, 图 1B)。对其所得产物的序列分析结果表明用5′端引物cadm2b-LS S1与3′端短片段匹配的引物cadm2b-LS AS1配对进行连锁分析只得到一条cDNA序列, 而与3′端长片段匹配的引物cadm2b-LS AS2配对进行连锁分析得到3条不同的cDNA序列。序列比对结果表明这4条cDNA在5′端区域的序列都完全相同, 只在3′端的3个局部区域有缺失片段的差异, 而每个cDNA的缺失片段都不同(图 2)。因此, 可以确定这4条不同的cDNA是cadm2b 的不同剪接体。

参考预测的斑马鱼cadm2b基因剪切突变体名称以及序列的同源性的比对, 我们将草鱼这4条mRNA序列分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6 (图 2)。cadm2b基因cDNA全长为1669 bp,开放阅读框(ORF)长1203 bp, 编码400个氨基酸, 其5′UTR长238 bp, 3′UTR长228 bp。 cadm2bX2 cDNA全长2783 bp, 开放阅读框长1323 bp, 编码440个氨基酸, 其5′UTR长238 bp, 3′UTR长1222 bp。cadm2bX3 cDNA全长2755 bp, 开放阅读框长1296 bp,编码431个氨基酸, 5′UTR长238 bp, 3′UTR长1221 bp。cadm2bX6 cDNA全长2649 bp, 开放阅读框1161 bp,编码386个氨基酸, 5′UTR长238 bp, 3′UTR长1250 bp。这些cDNA序列已经递交至GenBank, cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6的序列号分别为KT893252、KT599436、KT599437、KT-599438。

图 1 草鱼cadm2b 全长mRNA的克隆过程Fig. 1 Schema of cloning cadm2b full-length cDNAs of grass carpA. 草鱼cadm2b 3′RACE产物的电泳图谱; B. 克隆草鱼cadm2b全长剪切突变体的引物位置; M. MarkerA. Gel electrophoretogram of 3′RACE products of cadm2b in grass carp; B. Positions of PCR primers used in cloning full length cDNAs of grass carp cadm2b splice variants. M. Marker

图 2 草鱼cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3、cadm2bX6 cDNA的差异Fig. 2 The differences of grass carp cadm2b, cadm2bX2, cadm 2bX3 and cadm2bX6 cDNAs相同的花纹标示具有相同核酸序列的cDNA片段, 平行双斜杠表示忽略部分相同的序列Same decorative box indicates the region with identical nucleotide sequence. Double parallel lines indicate the skipped identical nucleotide sequence

如图 2, 5′UTR区域的序列都相同。在CDS区域, cadm2bX2具有一段长27 bp的独有序列, 位于CDS区域的第962位到988位碱基; cadm2bX6则在1084位与1085位碱基之间较其余3个剪切突变体缺失一段长106 bp的序列, 这段序列在cadm2b和cadm2bX3中位于第1085到1190位碱基, 而在cadm2bX2序列中则由于其独有片段的影响位于1112到1217位碱基。值得注意的是, 从这个差异片段之后开始的直到polyA尾, cadm2bX2、cadm 2bX3和cadm2bX6这3个剪切突变体的碱基序列是完全一致的, 而cadm2b与其余3个剪切突变体的序列明显不同。

2.2 不同物种的cadm2b基因氨基酸序列比较和聚类分析

基于4个剪接体CDS区的核苷酸序列使用Primer Premier 5软件进行氨基酸序列预测, 获得4个剪接体可能的蛋白氨基酸序列。预测的草鱼CADM2b蛋白氨基酸序列经Jellyfish软件比对, 显示其与GenBank中斑马鱼CADM2a (NP_956958.1)、斑马鱼CADM2b (NP_001107027.1)、爪蟾CADM2 (NP_001005713.1)、黑猩猩CADM2 (XP_00944 4170.1)、鸡CADM2 (XP_004938397.1)、小鼠CADM2 (NP_848836.2)、人CADM2 (NP_001161 146.1)的同源基因蛋白序列相似性分别为73.3%、97.2%、60.6%、63%、52.7%、68.5%和61.4%。除斑马鱼以外, 在以上列举的物种中无其余3个蛋白亚型CADM2bX2、CADM2bX3和CADM2bX6的对应蛋白, 因此并未对它们进行蛋白比对。

基于CADM2b氨基酸序列的同源性分析, 我们集中现有其他物种的CADMs基因数据, 利用MEGA 5.1软件的Neighbor-joining方法构建了不同物种CADMs家族的系统进化树(图 3)。由图可见, 草鱼CADM2b首先与斑马鱼CADM2b发生聚类, 较其他物种具有最接近的亲缘关系。

图 3 依据草鱼CADM2b蛋白氨基酸序列所构建的部分脊椎动物进化树Fig. 3 The unrooted phylogenetic tree of some vertebrates based on CADM2b amino acid sequences

2.3 草鱼CADM2b蛋白中功能区域结构域的预测

使用NCBI和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)在线分析软件对预测的草鱼CADM2b蛋白和3个转录突变体CADM2bX2、X3、X6蛋白进行蛋白结构域分析。分析结果表明, CADM2b和CADM2bX2、X3、X6都具有CADM家族保守的4个功能区, 但存在蛋白结合位点的差异(图 4)。在N端, 4个蛋白的第1到第24位氨基酸均为蛋白的信号肽结构, 3个Ig样(Immunoglobulin-like, Ig-like)结构域分别位于蛋白序列的第35到第129位, 第151到第229位, 第247到第 310位。3个Ig结构域从前到后分别属于Ⅴ型、C1型和Ⅰ型Ig结构域, 第一个Ig结构域与人类CADM2蛋白的第一个Ig样结构域高度相似, 第二个Ig结构域与人类所有CADMs家族(CADM1、2、3、4)蛋白中的第二个Ig样结构域高度相似, 而第三个Ig样结构域与人类CADM2蛋白的第3个Ig样结构域有着高度的相似性。在C端, 这4个蛋白均具有一个单次跨膜结构域：在CADM2b和CADM2bX3、CADM2bX6中位于第335到第357位氨基酸, 在CADM2bX2中则位于第344到第366位氨基酸。CADM2b、CADM2bX2、CADM 2bX3中具有与4.1蛋白相互作用的位点。该位点在CADM2B和CADM2bX3中定位于第358到第371位氨基酸上, 在CADM2bX2中则定位于第367到第380位氨基酸上。在4个由前体mRNA不同剪接而形成的蛋白质中, 只有CADM2b具有与PDZII型蛋白相互作用的位点, 该位点定位于C端末端的第397到400位氨基酸上。

图 4 草鱼CADM2b四种蛋白亚型的预测结构示意图Fig. 4 The prediction structures of four protein isoforms of CADM2b in grass carp

2.4 草鱼cadm2b基因在草鱼成体组织的表达

为了检测cadm2b基因在草鱼成体组织中的表达, 我们依据NCBI所提供的斑马鱼cadm2b基因内含子结构数据, 在草鱼cadm2b基因中设计了跨第四内含子的特异性引物。用草鱼基因组DNA进行的PCR扩增所获得的产物片段长长度在1600—1800 bp (图 5A), 而cDNA作为模板扩增的RT-PCR产物长度为150 bp (图 5B), 说明该引物的确是跨草鱼cadm2b基因的第四内含子。这一结果提示草鱼与斑马鱼cadm2b基因可能具有相似的基因组结构。

半定量RT-PCR只在成体草鱼的脑中检测到了cadm2b的表达, 在其他组织中没有检测到可分辨的表达(图 5B)。为确定在其他组织中是否有微量表达, 我们用套式PCR引物进行了第二轮检测。肝、肾、心脏和肌肉组织中都能检测到cadm2b的表达,而在鳃和胰腺组织中仍然检测不到表达(图 5B)。这些结果说明成体草鱼中cadm2b在脑中有高水平表达, 在肝、肾、心脏和肌肉组织中有较低水平的表达, 在鳃和胰腺组织中不表达。草鱼中的这种组织表达式样与小鼠中cadm2的组织表达式样[23]相似, 即主要表达于脑组织中, 同时也在多种组织中有微量表达。

图 5 草鱼cadm2b基因在成体组织中的表达Fig. 5 The expression of cadm2b in various adult tissues of grass carpA. 以草鱼基因组DNA为模板扩增的cadm2b产物电泳图谱; B.以mRNA为模板的RT-PCR和套式PCR电泳图谱; C. cadm2bX2与cadm2b在不同成体草鱼组织中的相对表达量, 误差线代表平均数标准差; 套式PCR中脑组织所用模板为稀释200倍的RTPCR产物, 其余组织为稀释100倍的RT-PCR产物;1—7分别为脑, 肝, 肾, 鳃, 胰, 心, 肌肉样品; M. 分子长度标记A. Gel electrophoretogram of PCR products amplified from grass carp genome DNA template; B. Gel electrophoretogramof RTPCR and nested-PCR products; C. The expression of cadm2bX2 and cadm2b in different adult tissues, bar ralats represent mean standard deviation. The templates used in nested primer PCR are the 200 and 100 times diluted RT-PCR products in the brain and other tissues, respectively. 1—7 stands for brain, liver, gill, kidney, pancreas, heart, muscle tissue, respectively. M. molecular length markers

在4个剪接体中cadm2bX2和cadm2b分别在其序列中部和3′ 端的差异剪接位点有独有序列, 可以设计特异性扩增引物。为了解不同剪接突变体在成体组织中的丰度是否存在差异, 我们用实时定量RT-PCR方法比较了cadm2bX2和cadm2b剪接突变体在成体组织中的丰度差异。检测cadm2bX2的定量引物为: RTX2 S: AGATTTCCCAGGTACAA CTACAGATCCTAACGCT, RTX2 AS: TGATGA AGCACAGGGTGATGAAGAC, 跨越3′ 端的差异剪接位点。检测cadm2b的定量引物为: RT cadm2b S: ACACTGCCATCATCAATGCGGAGGGGA ACC, RTcadm2b AS: AACAGAGACAAAGCCAG ACCAGACT, 跨越中部的差异剪接位点。电泳检验结果表明这两对引物的RT-PCR产物都为单一特异性产物。实时定量RT-PCR结果表明在脑组织中cadm2b和cadm2bX2两种剪接体都有高水平表达,但cadm2b剪接体的丰度比cadm2bX2剪接体的丰度高约4倍; 在肝、肾、鳃、胰、心脏和肌肉等组织中都只检测到微量的cadm2b剪接体存在, 没有检测到cadm2bX2剪接体的存在 (图 5C)。

3 讨论

本实验使用RT-PCR、RACE等方法克隆了草鱼cadm2b基因的4条长度不同的cDNA全长序列。序列比对分析表明这些mRNA是cadm2b基因的不同剪接突变体, 分别命名为cadm2b, cadm2bX2、X3、X6。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区, 但其蛋白结合位点存在差异。CADM2b剪接突变体具有全部功能区,而其他3个剪接突变体都有功能区缺失; 实时定量RT-PCR检测结果表明cadm2b剪接突变体的丰度显著高于cadm2bX2, 提示CADM2b剪接突变体可能是该基因的主要表达形式。在草鱼成体组织中cadm2b基因在脑中高水平表达, 在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达, 提示草鱼中CADM2b主要由非免疫细胞, 而不是由免疫肥大细胞特异性表达分泌的细胞黏附因子。

3.1 草鱼基因组中cadm2b 前体mRNA上可能有3个选择性剪接位点

Thomas Biederer[26]研究发现, 在人类基因组中cadm2基因有10个外显子。第一个外显子存在一个替代剪接供体位点(Alternative splice donor sites),不同剪接突变体之间比对发现选择性剪接现象出现在第八个外显子处, 共产生3种剪接突变体。在小鼠基因组中cadm2b有11个外显子, 选择性剪接现象出现在第九外显子处, 共产生2种剪接突变体。斑马鱼基因组中cadm2b有10个外显子[26], NCBI数据库中预测可能产生7个剪接变体, 但尚无克隆不同剪接变体的实验报道。

我们所获得的草鱼四种不同的cadm2b mRNA剪接体中, cadm2b 编码区从3′末端的最后13个碱基到整个3′UTR区域的序列与其他3个剪接的相应序列都完全不同, 说明在草鱼cadm2b 基因的3′端区域有一个选择性剪接位点, 2种不同的剪接方式。在cadm2bX6编码区靠近的3′端的1084位与1085位碱基之间缺失一段在其他3个剪接突变体中都存在的序列, 说明在此处存在第二个选择性剪接位点, 两种不同的剪接方式。cadm2bX6在3′端的碱基序列虽然与cadm2bX2和X3相同, 但因不同的剪接选择而发生了移码突变导致了其后端所编码的氨基酸序列与cadm2bX2和X3完全不同。在cadm2bX2编码区第962位到988位碱基处有一段在其他3个剪接变体中都缺失的序列, 说明在该位置存在第三个选择性剪接位点, 2种不同的剪接方式。这3个选择性剪接位点的存在证明了鱼类的cadm2b基因具有比哺乳动物更多样化的转录后剪接方式, 也提示草鱼cadm2b可能有更多的mRNA剪接体。

3.2 草鱼CADM2b四个蛋白亚型功能的可能差异

在CADMs家族中, 蛋白N端的3个连续Ig结构域以非钙离子依赖的亲同性(Homophilic)、亲异性(Heterophilic)相互作用与靶受体结合, 介导跨膜细胞黏附的作用, 这与免疫细胞与靶细胞之间的识别和黏附作用密切相关。在C端, CADMs家族中的4.1蛋白结合位点能与4.1B/Dal1蛋白和4.1N蛋白发生相互作用[10,29]。4.1B蛋白[30]是一种的细胞骨架锚定蛋白, 它通过与跨膜蛋白胞质端的4.1蛋白结合位点相互作用, 直接介导细胞质膜与细胞骨架之间相互连接。位于C末端的PDZ结构域蛋白结合位点则在家族中和在进化上都高度保守[25], 特异性的与膜结合鸟苷酸激酶家族(Membrane-associated guanylate kinase, MAGUK)成员发生相互作用, 介导细胞信号的传递与细胞极性的维持[31]。目前发现能与CADMs家族发生相互作用的MAGUK家族成员有钙/钙调素相关丝氨酸蛋白激酶(Calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase, CASK)[16]、Dlg3[22](Discs large 3)、MPP3(Membrane proteinpalmitoylated 3)[9]和Pals2[32]。

根据草鱼cadm2b基因4种不同剪接体的序列所预测的4种CADM2b蛋白亚型中, 只有CADM2b具有与斑马鱼以及其他物种同源蛋白一致的所有功能区域, 即胞外区N端的短信号肽, 3个连续的Ig结构域, 连接蛋白胞外区和胞浆区的单次跨膜结构域,胞浆区的近膜4.1蛋白结合位点, 以及位于C末端的Ⅱ型PDZ结构域蛋白结合位点。因此, CADM2b可能具有靶细胞识别、黏附、信号传导和细胞极性维持等所有功能的蛋白质。其他3种蛋白质亚型都具有完整胞外结构域和单次跨膜结构域, 因此都可能起介导细胞间的黏附的作用。但CADM2bX2和CADM2bX3缺乏CADMs家族所共有的Ⅱ型PDZ蛋白结合位点, 不可能在介导细胞间黏附后, 进而起介导细胞信号的传递与细胞极性的维持的作用, 而只能起稳固细胞膜与细胞骨架间相互联系的作用。而CADM2bX6因同时缺乏与4.1蛋白和Ⅱ型PDZ结构域蛋白的结合位点, 则可能既不参与介导细胞膜与细胞骨架的连接, 也不参与信号传导和细胞极性的维持, 仅仅参与介导细胞间识别与黏附,作为细胞膜之间的锚定分子起巩固细胞间黏附的作用。

3.3 草鱼cadm2b可能在成体不同组织中介导细胞黏附

成体草鱼cadm2b基因不仅在脑组织中高水平表达, 也在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。在成体草鱼中的这种组织表达式样与在成体小鼠中的组织表达式样高度相似。在成体小鼠中cadm2b主要表达于脑、嗅球和睾丸, 同时也在心脏、肺、肾、肝和消化道中存在极微量表达[5]。这种相似性提示在脊椎动物进化过程中cadm2b 基因的功能和组织特异性转录调控机制都是保守的。cadm2b 基因在草鱼中与在哺乳动物中一样, 也可能在多种组织和器官中介导多种不同细胞的黏附。由于草鱼CADM2b蛋白主要由非免疫细胞表达和分泌, 可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSING ANALYSIS OF CADM2B IN ADULT TISSUES OF GRASS CARP, CTENOPHARYNGODON IDELLUS

LIANG Jian-Jia1, ZHANG Qiong-Yu2, LI Heng1, ZHENG Jian-Bo1and LUO Chen1
(1. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. Department of Basic Medical Science, Yongzhou Vocational Technical College, Yongzhou 425100, China)

CADMs (cell adhesion molecules) family play important roles in establishing the first line of defense against illnesses and infections by mediating adhesion between immune mast cells and their target cells. Grass carp (Ctenopharyngodon idellus) has low livability at the age of 1 and 2 due to its susceptibility to infection by virus or bacterium. To investigate whether CADMs participate in building the first line of defense against infection in grass carp, we cloned the mRNA of grass carp cadm2b, and identify 4 different full length cDNA of cadm2b from grass carp brain tissue. According to sequences alignment, sequences of the 5′ terminal are identical among all the four cDNAs while various deleted fragments found in three different position in their 3′ terminals. These results indicated that these four mRNAs, named cadm2b, cadm2bX2, cadm2bX3 and cadm2bX6, are splicing variants from cadm2b gene. The full length of cadm2b is 1669 bp with a 1203 bp long open reading frame (ORF) coding 400 amino acids. The full length of cadm2bX2 is 2783 bp with a 1323 bp long ORF coding 440 amino acids. The full length of cadm2bX3 is 2755 bp with a 1296 bp long ORF coding 431 amino acids. The full length of cadm2bX6 cDNA is 2649 bp with a 1161 bp long ORF coding 386 amino acids. Prediction of amino acid sequences base on nucleotide sequenceds showed that all the four CADM2b isoforms contain the four conserve functional domains of CADM family in the N-terminals, but the C-terminals are variance. CADM2b has a juxtamembrane 4.1 protein binding domain and PDZ type Ⅱ protein binding domain in the C-terminal. Both CADM2bX2 and CADM2bX3 lack the PDZ type Ⅱ protein binding domain. CADM2bX6 possesses neither the juxtamembrane 4.1 protein binding domain nor the PDZ type Ⅱ protein binding domain. Quantitative RT-PCR results suggested that splicing variant cadm2b is the main form of cadm2b mRNA. A highlevel cadm2b was detected in brain tissue and a very low-level cadm2b was detected in liver, kidney, heart and muscle. These findings suggest that CADM2b is a cell adhesion molecule synthesized and secreted by nonimmune cells, and might play a role in against various infections by mediating adhesion between immune mast cells and their target cells in grass carp.

Grass carp; cadm2b; Gene cloning; Tissue expression

Q344+.1

A

1000-3207(2017)01-0009-09

10.7541/2017.2

2016-01-25;

2016-06-17

浙江省科技重大专项(2012C12907-9)资助 [Supported by Scientific Research Funds of Zhejiang Provincial Science and Technology Department (2012C12907-9)]

梁健嘉(1990—), 男, 广西罗城仫佬族自治县人; 硕士; 主要从事发育生物学研究。E-mail: liangjianjiannick@126.com

罗琛, 男, 教授, 博士生导师; 主要从事细胞与发育生物学研究。E-mail: luoc@zju.edu.cn