花烟草再生与遗传转化体系的建立

丁海琴+曾祥玲+王艳丽+郑日如+王彩云

摘要：以花烟草（Nicotiana forgetiana）无菌苗植株的叶片为材料，研究不同NAA和6-BA组合培养的再生体系，得到最佳培養基配方为NAA浓度为0.1 mg/L和6-BA浓度为1.5 mg/L， 此时再生率达97%、平均芽数达8.65。以卡那霉素（Km）、头孢霉素（Cef）为筛选试剂，探讨了影响农杆菌介导的花烟草遗传转化因素，表明卡那霉素敏感性浓度为20 mg/L、头孢霉素抑菌浓度为300 mg/L，在菌液OD600 nm为0.2～0.4时最适侵染时间为5 min；最适筛选培养基（MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）、壮芽培养基Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）、生根培养基S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。以最佳组合进行遗传转化培养，获得的生根苗经炼苗移栽后存活35个株系，用CTAB法提取植物组织DNA，经PCR检测证实外源基因已转入植物组DNA中，阳性率为71%。

关键词：花烟草（Nicotiana forgetiana）；再生体系；根癌农杆菌；遗传转化体系

中图分类号：S681.9；Q813.1；Q813.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5384-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.055

Abstract： Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants， the effects of different concentrations of naphthalene-acetic acid（NAA） and 6-benzylamino purine（6-BA） to the regeneration system were explored. Results showed that optimum medium for the highest differentiation rate amounting to 97% and number of per buds up to 8.65 was MS medium with supplement of 0.1 mg/L Using leaf disks of Nicotiana forgetiana as explants，the effects of different concentrations of naphthalene-acetic acid（NAA） and 6-benzylamino purine（6-BA） on the leaf regeneration were analyzed. On the basis of the regeneration medium，the factors affecting the genetic transformation efficiency，such as Kanamycin（Km），Cefotaxime（Cef） and infection duration，were studied. Results suggested that the optimal concentration of Km for callus selecting was 20 mg/L，300 mg/L Cef could control the agrobacterium pollution and suitable infection duration was 5 min. The optimal medium for selecting（MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km），induction（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km） and rooting（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km） were also selected. Finally，35 transferred plants were obtained，and PCR analysis indicated that the exogenous gene had been integrated into the genome of transformed Nicotiana forgetiana.

Key words：Nicotiana forgetiana； regeneration system； Agrobacterium tumefaciens； genetic transformation system

花烟草（Nicotiana forgetiana）又称福吉特士烟草，起源于澳大利亚和北美洲[1]，与烟草（Nicotiana tabacum L.）、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）等同为茄科烟草属植物。其株型较小，株高1 m左右，花朵美丽，花色为稳定的洋红色，从初夏至降霜均可开放，具有较高的观赏价值，可在园林中普遍应用[2]。国外的报道主要包括其自交不亲和机理的研究[3]、与烟草属中多种野生种共同作为比较基因组学[4]、传粉生物学[5]、形态进化学[6]的重要研究对象等，如Bissell等[7]研究了烟草属N. forgetiana与N.alata两个物种的花朵形态学遗传规律。但因花烟草的自交不亲和性，通常需要人工授粉获得后代[8]，较耗费时力，而组培再生能够为其获得大量材料提供简单可靠的途径。

自Horseh等[9]首次以烟草为材料获得转基因植株以来，越来越多不同植物材料的遗传转化得以研究和应用[10，11]，为不同需求的基因功能分析提供了有效途徑[12，13]。普通烟草、本氏烟草等的再生与遗传转化体系不断更新完善[14-17]，成为观赏植物，尤其是木本观赏植物转基因功能验证的模式材料[18，19]。但是普通烟草的株型较大，占地多，不便于整体的开花调控；其花色易受光照、温度、湿度等环境因素的影响，容易干扰花色相关基因的结果[20]。相比而言，花烟草株型较小，花色为稳定的花烟草，便于管理和花色相关基因研究，但是至今鲜见其再生及遗传转化体系的报道。因此，以花色稳定且株型较小的观赏花烟草为材料，建立其再生及遗传转化体系，可为观赏植物花色基因的研究提供一种新的转基因模式材料。

1 材料与方法

1.1 材料

花烟草无菌苗，来源于华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室所建立的无菌苗株系，以40～50 d的花烟草叶片作为转化的受体材料。

MYB目的基因来源于桂花（Osmanthus fragrance），供试质粒为pCAMBIA2300s，含CaMV35S启动子及卡那霉素抗性基因；转化受体菌株为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，由华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室保存提供。检测正向引物为35S-F：ACGCACAATCCCACTATCCTTC。

头孢霉素（Cef）、卡那霉素（Km）、利福平（Rif）采用过滤灭菌，生长素NAA、细胞分裂素6-BA均用121 ℃下高温高压蒸汽灭菌。农杆菌培养基主要有LB+Km固体培养基、LB+Km+Rif液体培养基和MS液体培养基。

1.2 再生培养基的筛选

将40～50 d的无菌苗叶盘，接种于不同植物生长调节剂组合（A-F）的培养基（表1），在（25±2） ℃、16 h/d光照条件下培养，每个处理30个外植体， 30 d后统计再生率和平均芽数。

不定芽再生率=再生不定芽的外植体总数/接种外植体总数×100（%）；平均芽数=外植体再生不定芽总数/再生不定芽外植体总数。

1.3 遗传转化体系的建立

1.3.1 抗生素敏感性试验及头孢霉素抑菌浓度的确定 卡那霉素浓度筛选：配制卡那霉素0、10、20、30、40和50 mg/L的再生培养基，将30～50 d的无菌苗叶盘接种于不同的培养基上，在（25±2） ℃、16 h/d光照条件下培养，30 d后统计不定芽再生率和平均芽数。

头孢霉素抑菌浓度的确定。配置头孢霉素100、200、300、400 mg/L及20 mg/L卡那霉素的筛选培养基。叶盘侵染5 min后接种于不同的培养基上，30 d后统计菌落和叶盘再生情况。

1.3.2 农杆菌的培养与菌液准备 在含卡那霉素的固体培养基上平板划线，避光培养3 d。挑取单克隆置于含Km和Rif的LB液体培养基中（5 mL），28 ℃、200 r/min振荡培养至培养基颜色由酒红色变为橙红色。再进行继代培养，取1 mL菌液于50 mL培养基中，同样条件下培养至培养基颜色由酒红色变为浅橙红色，用分光光度计测定OD600 nm，OD600 nm为0.2～0.4左右可用。将菌液置于50 mL无菌的离心管4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入50 mL MS液体培养基，振荡使菌液重悬，28 ℃条件下200 r/min培养1 h即可。

1.3.3 叶盘的侵染 将无菌苗叶盘在重悬后的菌液中进行侵染，侵染时间设置梯度为2、5、8和 11 min，侵染完成后，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，暗培养3 d。

1.3.4 侵染后的培养 暗培养完成后，用含有Cef（300 mg/L）的无菌水清洗叶片8 min，再用无菌水清洗2～3遍，无菌滤纸吸干后，放入筛选培养基中培养。每隔15 d继代1次，直到长出小芽，再放入壮芽培养基（Z1、Z2）中培养。Z1（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。小芽长出3～4片叶时，切下放入生根培养基（S1、S2）中培养。S1（1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。培养室设置为（25±2） ℃、16 h/d光照。

1.3.5 生根苗的炼苗及移栽 将已生根且根长约2～3 cm、株高3～4 cm的叶片鲜绿组织培养壮苗带瓶移到光照培养箱中，选择光照适中的区域打开瓶盖，进行2～3 d光适应。然后将根洗净移栽于装有基质的小钵中，基质全部用清水浸湿，第一次浇水浇透，之后每隔2～3 d浇水1次，使基质见干见湿，至新根新叶发出，即移栽成活。

1.4 转基因花烟草的PCR检测

取筛选获得的转基因植株叶片，采用CTAB法提取植物组织总DNA，用CaMV35S启动子上游引物和MYB目的基因下游引物进行PCR扩增。扩增体系为5 μL Es Taq Mix、35S-F和MYB-R各0.5 μL、1 μL DNA模板、3 μL去离子水。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 S，60 ℃退火30 S，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。设置供试质粒为阳性对照，野生型花烟草为阴性对照，计算阳性率。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂组合对叶盘再生的影响

30 d后统计叶片再生情况发现，叶盘在NAA和6-BA不同浓度配比的培养基中再生率差别较大（表2、图1）。其中，B组合即当NAA浓度为0.1 mg/L、6-BA浓度为1.5 mg/L时，诱导效果最好，再生率达97%，平均芽数达8.65。叶盘1周左右开始诱导形成愈伤组织，2周后开始分化形成芽点，4周后芽点萌发形成整齐一致的丛生芽，适合作为遗传转化材料。

2.2 卡那霉素敏感性浓度及头孢霉素（Cef）抑菌浓度的确定

在预试验阶段，用50、100 mg/L的卡那霉素浓度进行筛选比较，花烟草叶盘在培养至20 d时已全部褐化。在此基础上设计含有0、10、20、30、40和50 mg/L卡那霉素再生培养基进行筛选比较。结果表明，花烟草叶盘对卡那霉素反应比较敏感（表3、图2）。当卡那霉素浓度为20 mg/L时，愈伤组织褐变率为90.9%，出芽率为2.0%，极少部分叶盘及愈伤组织能够维持绿色，并分化出部分绿芽。当卡那霉素浓度大于20 mg/L时，叶盘基本全部褐化，无法分化出绿芽。一般确定筛选浓度要略低于临界致死浓度，因此，本试验确定卡那霉素敏感性浓度为20 mg/L。

当头孢霉素浓度为300 mg/L时，基本能够抑制农杆菌的生长，且再生率最高为71.0%，当其浓度继续升高时，叶盘再生率下降，说明头孢霉素浓度过高时会抑制叶盘的生长（表4）。因此选择300 mg/L作为头孢霉素抑菌的适宜浓度。

2.3 农杆菌菌液侵染时间的确定

侵染时间是影响农杆菌侵染效果的重要因素，前人的研究中侵染时间从30 s到30 min均有采用[21]，其差异可能源于品种基因型不同。在菌液浓度基本一致（OD600 nm为0.2～0.4）的情况下，参照普通烟草的最佳侵染时间，设计梯度为2、5、8、11 min进行试验。结果表明，侵染时间以5 min为宜，当侵染时间过短时，农杆菌无法有效附着，则会降低转化植株的阳性率，当侵染时间过长时，叶盘容易被农杆菌污染，并可能在长时间内产生反菌现象，影响叶盘愈伤组织的形成和绿芽的分化（图3）。

2.4 壮芽、生根培养基的优化

2.4.1 壮芽培养基的优化 一般而言，筛选培养基分化出的小芽在壮芽培养基中培养一段时间后，再转入生根培养基中，更容易生根存活。在预试验阶段已经筛选出两种待选壮芽培养基，分别为Z1（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和Z2（MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。培养15 d后，两种培养基中小芽的生长状况见表5。Z1培养基中小芽能够继续生长，部分带叶盘或愈伤组织的小芽能够持续分化，形成更多的小芽，但是生根率较低。Z2培养基中大部分小芽开始生根，但是根系并不发达。Z2培养基生根率更高，效果更好，因此选择Z2用于后续试验。

2.4.2 生根培养基的优化 采用两种生根培养基S1（1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）和S2（MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km）。结果表明，虽然两者的生根率都偏低，而且生根缓慢，但是S2的生根率明显高于S1，且S2培养基中的小芽生长相对较快，小芽褐化率低（表6），选定S2作为生根培养基。

2.5 转基因花烟草的分子检测

用CTAB法提取经生根培养基筛选获得的部分抗性单株的DNA，并用PCR扩增法进行阳性检测（图4）。结果表明，在转化植株DNA中扩增出单一的目的条带，大小与预测大小一致；而未转化植株则没有，证实外源基因已转入花烟草DNA中。在经生根培养获得的35个抗性株系中，阳性株系为25个，阳性率为71.0%。

3 小结与讨论

本研究初步建立了花烟草再生与遗传转化体系。与普通烟草相比，其再生率、各种植物生长调節剂使用浓度和比例、卡那霉素敏感性浓度、筛选浓度、侵染时间及生根率等都有差别[14-17]。NAA和6-BA的浓度比例是叶片再生和芽萌发率的关键，对于不同植物种类或品种，两者的浓度比例呈现不同的效果。当NAA为0.1 mg/L，6-BA为1.5 mg/L时，花烟草的诱导效果最好，再生率达97%，平均芽数达8.65。当6-BA不变而NAA浓度升高时，再生率和平均绿芽数呈下降趋势。相比常用的普通烟草再生体系0.3 mg/L NAA与2.25 mg/L 6-BA，其浓度较低，6-BA与NAA的比例较高[16]。而与本氏烟草再生体系NAA 0.1 mg/L、6-BA 1.5 mg/L的比例基本一致，这可能与植物不同的基因型相关[15]。

在植物遗传转化过程中，所构建的载体、筛选浓度等因素对植物的转化效率有很重要的影响[21，22]。其中，载体的影响尤为重要，因不同载体其所携带的筛选抗生素的种类不同，而试验选用的筛选抗生素的种类在很大程度上决定了转化效率的高低。在有关烟草属转化的报道中，大部分遗传转化试验采用以卡那霉素为筛选抗生素的载体，筛选效果良好[14，16，17]。本研究采用以卡那霉素为筛选抗生素的载体，获得卡那霉素最适筛选浓度为20 mg/L，与普通烟草相比，其对卡那霉素的敏感性较高，筛选浓度较低。此外，采用头孢霉素为抑菌试剂，获得适宜抑菌浓度为300 mg/L。与普通烟草使用的400 mg/L相比，浓度偏低[16]。

在筛选壮芽、生根培养基的试验中，低浓度的NAA和6-BA促进小芽在壮芽培养基上产生部分根系，全MS营养比1/2MS营养供给更有利于植株产生发达的根系。一般而言，转基因植株会因难以生根而较难存活，会在一定程度上阻碍试验的整体进展，也会降低遗传转化体系的稳定性[21]。在烟草属的遗传转化中较理想繁荣其生根率和移栽存活率达到了90%以上[17]，而本试验的2种生根培养基中植株的生根率都相对较低，对生根培养基以及提高移栽成活率需要进一步研究。

本研究初步建立了花烟草再生与遗传转化体系。在再生体系中，适宜组合为0.1 mg/L NAA与1.5 mg/L 6-BA。在遗传转化体系中，卡那霉素敏感性浓度为20 mg/L，抑菌抗生素头孢霉素为300 mg/L，在菌液侵染浓度OD600 nm为0.2～0.4时，适侵染时间为5 min。最适筛选培养基为MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km，最适壮芽培养基为MS+0.01 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km，最适生根培养基为MS+0.1 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+20 mg/L Km。获得的生根苗经炼苗移栽后存活35个株系，用CTAB法提取植物组织DNA，经PCR检测初步证实外源基因已转入植物组DNA中，本研究为后续的MYB基因功能验证奠定了基础。

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