响应面法优化白首乌多糖提取的研究

刘 颖，赵 雪，，柴 智，贾成琦，李春阳

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014；3.江苏海苑食品有限公司，江苏滨海 224000）

响应面法优化白首乌多糖提取的研究

刘 颖1，赵 雪1，2，柴 智2，贾成琦3，*李春阳2

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014；3.江苏海苑食品有限公司，江苏滨海 224000）

白首乌中多糖含量丰富，为改善目前实际生产中白首乌水溶性成分利用不足的现状，实现白首乌资源的充分开发，采用响应面法优化提取白首乌多糖的工艺条件，以期为这一水溶性功能成分的开发提供基础。选择料液比、提取温度和提取时间3个因素进行单因素试验，根据单因素试验结果设计中心组合试验，采用响应面法确定最优工艺参数。结果表明，白首乌多糖的最优提取工艺为料液比1∶17，提取温度91℃，提取时间3 h。在此条件下，白首乌多糖得率为1.58%，与模型的预期值1.61%基本相符。由此可见，响应面法对白首乌多糖提取条件进行优化合理可行，具有较高的应用价值。

多糖；白首乌；响应面；提取工艺

滨海白首乌 （Cynanchum auriculatum Royle ex Wight），原植物为萝藦科耳叶牛皮消，是江苏省滨海县著名的传统特产，也是我国传统的“药食同源”植物、道地中药材。全国95%白首乌产于江苏省滨海县，当地农民种植白首乌的历史悠久，是我国著名的首乌之乡。滨海白首乌是全国首乌行业唯一获得国家3项地理标志保护的原产地保护产品，也是唯一经国家卫生计生委办公厅批复“作为有传统食用习惯的普通食品管理”的白首乌品种[1-2]。白首乌含有丰富的营养成分（如蛋白质、维生素、微量元素等）和生物活性物质（如C21甾甙及甙元类成分、磷脂类成分、苯酮类成分等）[3-4]。经龚树生等专家的产地调查、史料考证和临床效果认定，白首乌具有重要的生理活性功能和医疗价值，其补益作用优于赤首乌，是一种有前途的抗衰老药。滨海白首乌由于其资源的垄断性、产品功能的多样性及作为天然产物的安全性，已引起越来越多研究者的关注，成为一种极具开发前景的优良功能食品基料。

多糖在自然界中广泛存在，近年来研究发现多糖具有较高的药用价值，如抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等[5-8]。来源于天然植物、真菌等活性多糖的开发是目前研究和利用的热点问题，有大量研究已经对人参、灵芝等多糖进行了报道，而白首乌多糖的研究仍处于水提物等初级阶段，相关多糖组成及其相应药理作用关系尚不明确。这方面的研究空白，将会导致对白首乌深度开发及应用时缺乏相应数据的支持和理论指导。目前，对白首乌的深入研究和开发利用多集中在其醇溶性成分上，如白首乌中发现数量最多的活性组分C21甾体成分[9-10]；而水溶性成分，如白首乌多糖，多数随废水和废渣排弃，研究利用不足，既浪费了资源，又污染了环境。因此，开发利用白首乌这一传统的“药食同源”资源，优化白首乌多糖的提取工艺，对扩大其应用和工业化生产具有现实意义。试验以滨海白首乌为原料，采用水提醇沉法对多糖进行提取，并用响应面法优化提取工艺，为其扩大应用和工业化生产提供相对准确的试验数据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

滨海白首乌，2年生；液化酶、糖化酶，均采购于江苏锐阳生物科技有限公司；葡萄糖、石油醚、浓硫酸、苯酚、氯仿、无水乙醇、正丁醇、丙酮，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HJ-6A型数显恒温磁力加热搅拌器，金坛市白塔新宝仪器厂产品；RE-5203型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；PHS-3C型pH计，上海康仪仪器有限公司产品；DD-5M型离心机，湘仪离心机有限公司产品；UV-5500型扫描型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品。

1.3 原料的预处理

白首乌粉末→石油醚脱脂（料液比1∶4，50℃，磁力搅拌1.5 h，2次）→离心（3 500 r/min，10 min）→残渣于60℃烘箱中烘干→干粉保存备用。

1.4 白首乌多糖提取

称取一定质量的白首乌干粉，加入适量的水，混合均匀，置于固定温度下搅拌一定时间，经离心后得多糖浸提液。将多糖浸提液进行去淀粉[12]、浓缩，浓缩液用Sevag法脱蛋白[13]，直至中间层无白色沉淀。脱蛋白后的浓缩液置于4℃下醇析、离心，所得沉淀物用80%乙醇和丙酮洗涤，加入少量水复溶，透析48 h，冷冻干燥。

1.5 单因素试验

设定料液比1∶15，提取温度80℃，提取时间4 h，固定其他因素，分别考察料液比、提取时间和提取温度对白首乌多糖得率的影响。

1.6 白首乌多糖含量的测定

1.6.1 标准曲线的制作

采用苯酚硫酸法测量溶液中白首乌多糖含量。准确称取已经干燥至恒质量的标准葡萄糖20 mg定容于500 mL容量瓶中，分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL标准葡萄糖溶液，各以蒸馏水补至2.0 mL，以2.0 mL蒸馏水为空白，然后各加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀冷却，室温静置20 min后于波长490 nm处测定吸光度。以白首乌多糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，得标准曲线。标准曲线的回归方程为Y=0.067 X-0.002 8，R2=0.999 4。

1.6.2 样品多糖含量的测定

取多糖透析液0.05 mL，用蒸馏水补至2.0 mL，按上述步骤测其吸光度。以标准曲线计算白首乌多糖含量。

1.7 白首乌多糖提取的中心组合试验[14-15]

在单因素的基础上采用Box-Benhnken试验设计，并运用响应面软件（Design Expert 8.0.6） 进行试验分析。分别以X1，X2和X3表示3个因素，以-1，0，1表示各因素的3个水平。

试验因素及水平设计见表1。

表1 试验因素及水平设计

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

2.1.1 料液比对白首乌多糖得率的影响

料液比对白首乌多糖得率的影响见图1。

图1 料液比对白首乌多糖得率的影响

由图1可知，随着料液比的增加，白首乌多糖得率呈明显的上升趋势，当料液比达到1∶20后，多糖得率增加缓慢。可见，增大料液比有利于白首乌多糖的提取，但是增大到一定程度后，白首乌多糖的得率基本上趋于平稳，同时过大的料液比也会增加能耗和后续工作量。因此，白首乌多糖的料液比选1∶20为宜。

2.1.2 提取温度对白首乌多糖得率的影响

提取温度对白首乌多糖得率的影响见图2。

图2 提取温度对白首乌多糖得率的影响

由图2可知，随提取温度的上升，白首乌多糖得率迅速增加，提取温度到达90℃后，多糖得率增加缓慢；达到100℃时，多糖得率略有所下降。可能是由于高温条件下部分多糖发生水解，导致后续分离过程中的损失，同时提取温度过高也会导致淀粉等其他杂质浸出增加，对白首乌多糖的分离造成不便[16]。因此，白首乌多糖的提取温度选90℃左右为宜。

2.1.3 提取时间对白首乌多糖得率的影响

提取时间对白首乌多糖得率的影响见图3。

图3 提取时间对白首乌多糖得率的影响

由图3可知，在一定的时间内，白首乌多糖得率随提取时间的增加而增加，在3 h处达到最高值，继续增加提取时间，白首乌多糖得率降低。可能是由于提取时间过长，使部分多糖发生降解。因此，白首乌多糖的提取时间选3 h为宜。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken中心组合试验法，选取了对白首乌多糖得率影响较大的3个因素（料液比、提取温度、提取时间）进行三因素三水平的中心组合试验，以白首乌多糖得率为响应值，通过响应面分析优化白首乌多糖的提取工艺条件。

响应面试验设计及结果见表2。

利用Design Expert 8.0.6软件对数据进行二次多元回归拟合，得到白首乌多糖得率（Y）对自变量的二元多次回归方程如下：

Y=1.55+0.18X1+0.12X2+0.11X3+0.027X1X2+ 0.11X1X3+0.023X2X3-0.33X12-0.50X22-0.31X32.

2.3 回归模型有效性及显著性分析

利用Design Expert 8.0.6软件对表中响应面方案和结果进行回归拟合分析，对回归模型进行方差分析，并检验回归方程系数的显著性。

表2 响应面试验设计及结果

响应面设计试验方差分析及回归系数显著性检验见表3。

表3 响应面设计试验方差分析及回归系数显著性检验

对模型进行方差分析可以看出，试验数据所得的模型中F=548.11，p＜0.000 1，表明该模型极显著。失拟项的p=0.080 2＞0.05，不显著，且回归方程的总决定系数R2=0.998 6，调整决定系数R2adj=0.996 8，说明所建立的回归方程拟合度和可信度较高，能够很好地对白首乌多糖得率进行预测。方程中提取温度和提取时间交互项、料液比和提取温度交互项对白首乌多糖得率的影响不显著，其他项均达到了极显著水平，3个因素对白首乌多糖得率的影响顺序为X1＞X2＞X3，即料液比＞提取温度＞提取时间。

2.4 响应面分析

响应面三维图可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响，曲线越陡，表示该因素对响应值的影响越大；曲线越平滑，表明该因素对响应值影响越小。比较响应面三维图可知，在所选范围内存在极值，即响应面最高点。

料液比和提取温度的交互作用对白首乌多糖得率的影响见图4，料液比和提取时间的交互作用对白首乌多糖得率的影响见图5，提取温度和提取时间的交互作用对白首乌多糖得率的影响见图6。

图4 料液比和提取温度的交互作用对白首乌多糖得率的影响

图5 料液比和提取时间的交互作用对白首乌多糖得率的影响

图6 提取温度和提取时间的交互作用对白首乌多糖得率的影响

由图4可知，提取时间为3 h时，白首乌多糖得率随料液比和提取温度的增加呈上升趋势，当提取温度达91℃，料液比1∶17时，白首乌多糖得率达到最大值。

由图5可知，提取温度为90℃时，白首乌多糖得率随料液比和提取时间的增加呈先增加后平稳的趋势。当提取时间约3.2 h，料液比约1∶17.5时，白首乌多糖得率达到最大值。

由图6可知，料液比为1∶15时，随提取温度和提取时间的增加，白首乌多糖得率提高。当提取温度约92℃，提取时间为3.1 h时，白首乌多糖得率达到最大值；随后再继续增加提取温度和提取时间，白首乌多糖得率趋于平稳。

2.5 最佳条件优化及验证试验

根据回归模型的分析结果，得到白首乌多糖提取的最优工艺为料液比1∶17，提取温度91℃，提取时间3.24 h，该条件下白首乌多糖得率的预测值为1.61%。考虑实际的操作情况，将最佳提取工艺修正为料液比1∶17，提取温度91℃，提取时间3 h；在此提取条件下，进行3组平行试验，所得白首乌多糖得率的平均值为1.65%。预测值与实测值非常接近，偏差较小，说明运用响应面法优化得到的模型参数准确可靠。

3 结论

试验通过选取料液比、提取温度和提取时间3个因素进行响应面分析，并由回归模型的方差分析结果可知各个因素对白首乌多糖得率的影响均显著，其影响顺序为料液比＞提取温度＞提取时间。利用响应面法优化白首乌多糖的最优提取工艺为料液比1∶17，提取温度91℃，提取时间3 h。在此条件下白首乌多糖的得率为1.58%，接近于多糖的预测值1.61%，误差较小，表明采用响应面法分析优化白首乌多糖的提取工艺准确可靠，具有很高的应用价值，可以在天然产物提取研究中进一步推广。

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Optimization of Extraction Technology of Polysaccharide from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight by Response Surface Methodology

LIU Ying1，ZHAO Xue1，2，CHAI Zhi2，JIA Chengqi3，*LI Chunyang2

（1.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2.Institute of Agricrltural Products Processing，Jiangsu Academy of Agricutural Scienes，Nanjing，Jiangsu 210014，China；3.Jiangsu Haiyuan Food Co.，Ltd.，Binhai，Jiangsu 224000，China）

Cynanchum auriculatum Royle ex weight full of polysacharede.Response surface methodology is used to optimize the extraction conditions of polysaccharide from，aimming to yield the maximum polysaccharide from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight.The effects of material liquid ratio，extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharide are evaluated in single factor experiments.Subsequently，based on the three factors，a polysaccharide yield regression model is established using the central composite design.Then，the optimum levels of these three factors are obtained by the response surface analysis.The result shows that the optimum extractions are solid-liquid ratio of 1∶17，extraction temperature of 91℃，extraction time of 3 h.Under these conditions，the maximum experimental polysaccharide yield is 1.58%，which is basically consistent with the predictied one of 1.61%.

polysaccharide；Cynanchum auriculatum Royle ex Wight；response surface methodology；extraction

R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.001

1671-9646（2017）01a-0001-04

2016-11-11

苏北科技发展计划“富民强县项目”（BN2014147）。

刘 颖（1968— ），女，博士，教授，研究方向为粮食加工。

*通讯作者：李春阳（1966— ），男，博士，研究员，研究方向为营养与活性物质、农产品精深加工。