基于HPLC-MS/MS法研究马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的大鼠肝微粒体酶S9体外代谢

周 慧，付 佳，蔡宗苇

(1.吉林大学珠海学院，广东 珠海 519041；2.香港浸会大学化学系，香港特别行政区)

基于HPLC-MS/MS法研究马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的大鼠肝微粒体酶S9体外代谢

周 慧1，付 佳1，蔡宗苇2

(1.吉林大学珠海学院，广东 珠海 519041；2.香港浸会大学化学系，香港特别行政区)

马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ广泛存在于马兜铃属植物中，具有肾损伤毒性和致癌致突变毒性。为了研究马兜铃酸类化合物的毒性产生机制，建立了马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ及其大鼠肝微粒体酶S9代谢物分离与鉴定的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法。采用体外代谢法分别研究了有氧和厌氧孵育条件下，马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ在大鼠肝微粒体酶S9作用下的代谢行为，并对各代谢物进行结构表征。研究结果显示：马兜铃酸Ⅰ在有氧条件下生成的代谢产物为马兜铃酸Ⅰa，在厌氧条件下生成的代谢产物为马兜铃内酰胺Ⅰ；马兜铃酸Ⅱ只在厌氧条件下生成了马兜铃内酰胺Ⅱ。马兜铃内酰胺类化合物的生成是马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ在肝微粒体酶S9代谢过程中毒性产生的主要原因。该结果对于更好地理解马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的毒性作用机制，控制毒副反应的发生具有一定意义。

马兜铃酸Ⅰ；马兜铃酸Ⅱ；肝微粒体；代谢；高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)

马兜铃属植物(马兜铃、关木通等)具有广泛的生物活性和药理作用，如抗肿瘤、抗菌、抗炎以及镇痛等。马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ是马兜铃科植物的活性成分，同时也被认为是肾毒性和致癌致突变性的主要成分[1-7]。但是，关于马兜铃酸类化合物引起毒性的机制尚不明确，且该类化合物在人体内的吸收、分布、代谢及消除过程也未被充分阐明。因此，研究马兜铃酸类化合物的体外代谢行为，不仅有助于进一步阐释该类物质的体内代谢行为，并且也有助于深入研究马兜铃酸类化合物的毒理机制，从而为其毒副作用的防治提供理论依据。

肝脏是药物的重要代谢器官，是药物生物转化的主要场所，该系统富含参与药物代谢的庞大的依赖细胞色素的混合功能氧化酶，大多数药物的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在肝药酶系统的参与下发生的。体外肝脏代谢研究不仅可以排除体内诸多因素的干扰，还具有反应干扰小、操作简单、代谢条件易于控制等优点；同时，体外代谢还能迅速有效地解决药物代谢中的关键问题，例如代谢物结构鉴定、代谢途径推断等，它可为体内代谢研究提供重要的线索和依据[8-10]。

本研究拟采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法研究马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的代谢行为，并总结其质谱碎裂特征。在此基础上，分析马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ与大鼠肝微粒体S9组分在有氧和厌氧条件下孵育产生的体外代谢产物，结合串联质谱信息，对其代谢物进行结构鉴定。希望该研究能够为明确马兜铃酸类化合物的毒理机制，控制毒副反应的发生提供方法学参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

HP 1100液相色谱：美国Hewlett-Packard公司产品；Esquire 4000离子阱质谱仪：德国Bruker公司产品；Sanorius BSl10S分析天平：北京赛多利斯有限公司产品；Eppendorf 5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司产品；MDF-382E型超低温冰箱：日本SANYO公司产品。

1.2 主要材料与试剂

马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ标准品：美国Acros公司产品；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)：日本Oriental Yeast Co.公司产品；二甲基亚砜(DMSO)：澳大利亚AJAX Chemicals公司产品；甲醇、乙腈：均为色谱纯，美国Tedia公司产品；纯净水：由Milli-Q超纯水处理系统制得；其他试剂均为分析纯。

清洁级雄性SD大鼠10只，其质量为(200±20) g，由香港中文大学实验动物中心提供。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；洗脱条件：0～5 min(30%～42%B)，5～10 min(42%～46%B)，10～15 min(46%～50%B)，15～35 min(50%～65%B)；流速0.3 mL/min；柱温28 ℃；进样体积5 μL。

1.3.2 质谱条件 电喷雾电离源(ESI)，正离子全扫描模式，质量扫描范围m/z100～500，喷雾电压4.0 kV，干燥气温度300 ℃，干燥气流速8.0 L/min，雾化气压力200 Pa，源内碰撞诱导解离气为氦气。

1.4 肝微粒体S9组分的制备

雄性SD大鼠在湿度和温度可控制的动物房适应1周，自由进水进食，动物房灯光按12 h方式自动交替开关。一周后，处死SD大鼠，迅速取出肝脏，用冰冷的生理盐水清洗并称其质量；将肝脏剪成小块后，用4倍质量的冰冷的磷酸缓冲液(PBS 缓冲液，pH 7.4，100 mmol/L)制成20%匀浆，于4 ℃下以9 000 r/min离心10 min，弃去上层脂质和下层沉淀物后的上清液即为大鼠肝微粒体S9组分。

1.5 体外代谢反应及样品制备

1.5.1 有氧条件下的体外孵育 分别取60 μmol马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ标准溶液于1.5 mL聚苯乙烯管中，加入4 μmol NADPH，5 μmol葡萄糖-6-磷酸，8 μmol氯化镁和1.65 μmol氯化钾，混匀后置于37 ℃水浴中预孵育5 min，再加入500 μL蛋白质浓度为2.0 g/L肝微粒体S9组分的KCl-PBS缓冲溶液，分别得到马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ在有氧条件下的孵育体系。将孵育体系置于37 ℃水浴中，孵育0 min和60 min后，分别取100 μL孵育混合溶液，加入2倍体积的冰冷的乙酸乙酯，萃取2次，收集上清液，合并后于37 ℃氮气干燥；最后用50 μL甲醇溶解样品，供LC/MS测定。每组平行做3份。

1.5.2 厌氧条件下的体外孵育 厌氧条件下的孵育溶液的制备与有氧条件下的相同。接下来，在孵育体系中通入15 min氩气并密封，将孵育体系置于37 ℃水浴中，孵育0 min和60 min后，分别取100 μL孵育混合溶液，按照有氧条件下的样品制备方法得到马兜铃酸Ⅰ或马兜铃酸Ⅱ在厌氧条件下的体外孵育样品。每组平行做3 份。

2 结果与讨论

2.1 马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的液相色谱-质谱分析

马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ及其代谢产物的LC/MS提取离子流色谱图示于图1。

图1 马兜铃酸Ⅰ(a)和马兜铃酸Ⅱ(b)及其代谢产物(c～e)的LC/MS提取离子流色谱图Fig.1 Selective ion chromatogram of aristolochic acid Ⅰ (a), aristolochic acid Ⅱ (b) and their in-vitro metabolites (c-e)

马兜铃酸Ⅰ的保留时间为17.12 min，准分子离子为[M+NH4]+m/z359和[M+H]+m/z342。m/z359离子在二级质谱中生成碎片离子m/z324 [M+H—H2O]+、m/z298 [M+H—CO2]+和m/z296 [M+H—NO2]+，其中m/z298离子的丰度最高，其裂解途径示于图2，这与文献[11]报道的马兜铃酸Ⅰ的碎裂方式一致。

马兜铃酸Ⅱ的保留时间为16.65 min，准分子离子为[M+NH4]+m/z329和[M+H]+m/z312。m/z329离子在二级质谱中生成碎片离子m/z294 [M+H—H2O]+、m/z268[M+H—CO2]+(基峰)和m/z238[M+H—CO2—CH2O]+，其裂解途径示于图3。可以看出，马兜铃酸Ⅱ与马兜铃酸Ⅰ具有相似的电喷雾质谱规律，即在一级质谱中易形成[M+NH4]+加合离子，在二级质谱中易发生CO2中性碎片丢失。

图2 马兜铃酸Ⅰ的二级质谱图(a)和裂解途径(b)Fig.2 MS2 of aristolochic acid Ⅰ [M+NH4]+m/z 359 (a) and fragmentation pathways proposed (b)

图3 马兜铃酸Ⅱ的二级质谱图(a)和裂解途径(b)Fig.3 MS2 of aristolochic acid Ⅱ [M+NH4]+m/z 329 (a) and fragmentation pathways proposed (b)

2.2 马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ体外大鼠肝微粒体S9代谢产物分析

马兜铃酸Ⅰ和大鼠肝微粒体S9组分在有氧条件下孵育60 min后的反应体系与相同条件下孵育0 min后的反应体系相比，在总离子流色谱图中，保留时间16.25 min处检测到马兜铃酸Ⅰ的代谢产物峰(图1c)，其准分子离子[M+NH4]+m/z345比马兜铃酸Ⅰ的准分子离子[M+NH4]+m/z359减少了14 u，这可能是马兜铃酸Ⅰ的甲氧基丢失亚甲基形成羟基所致。MS2中的碎片离子为m/z328、310、284、282，均比对应的马兜铃酸Ⅰ在同样条件下所得的MS2碎片离子m/z342、324、298、296减少了14 u，说明两者具有相似的断裂方式，故可初步推断其代谢产物与马兜铃酸Ⅰ的结构相似。分析马兜铃酸Ⅰ在有氧孵育下代谢产物的二级质谱发现，其裂解规律与文献[12-13]报道的马兜铃酸Ⅰa相同，故鉴定为马兜铃酸Ⅰa，质谱图及裂解途径示于图4a。其中，m/z328离子为马兜铃酸Ⅰa的[M+H]+峰，m/z310、284、282离子为马兜铃酸Ⅰa [M+H]+离子分别脱去水(—H2O)、二氧化碳(—CO2)以及丢失硝基(—NO2)而得到的碎片离子。

马兜铃酸Ⅰ在厌氧条件下孵育的代谢产物保留时间为19.52 min(图1d)，准分子离子为[M+H]+m/z294。m/z294离子在二级质谱中分别丢失甲基(—CH3)、乙酰基(—CH3CO)以及同时丢失乙酰基和甲醛(—CH3CO—CH2O)而生成m/z279、251、221碎片离子，其质谱图及裂解途径示于图4b。这与文献[12-13]报道的马兜铃内酰胺Ⅰ的质谱裂解规律一致，据此推测马兜铃酸Ⅰ在厌氧孵育条件下的代谢产物为马兜铃内酰胺Ⅰ。

同样，分别在有氧和厌氧条件下对马兜铃酸Ⅱ和大鼠微粒体S9组分进行孵育，但仅检测到厌氧条件下孵育的代谢产物(图1e)，其保留时间为18.68 min，准分子离子为[M+H]+m/z264。在二级质谱中，m/z264离子丢失一分子甲醛(CH2O)产生m/z234离子；同时丢失CH2O和CO产生m/z206离子；同时丢失CH2O、CO和HCN产生m/z179离子，其质谱图及裂解途径示于图4c。结合文献[12-13]报道，推测马兜铃酸Ⅱ在厌氧孵育条件下的代谢产物为马兜铃内酰胺Ⅱ。

以上研究结果表明，马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的代谢反应类型与孵育体系中是否含氧密切相关。马兜铃酸Ⅰ在有氧条件下的代谢反应主要是去甲基化，生成无毒的马兜铃酸Ⅰa，从而起到解毒作用；而在厌氧条件下的代谢反应是硝基还原，生成毒性较强的马兜铃内酰胺Ⅰ。马兜铃酸Ⅱ在有氧条件下没有发生变化，只有在厌氧条件下发生了硝基还原反应，生成毒性较弱的马兜铃内酰胺Ⅱ。由此可见，马兜铃酸的毒性成分主要来源于马兜铃酸在厌氧条件下的代谢产生的马兜铃内酰胺类成分。据文献[14]报道，马兜铃内酰胺类成分能够入肾小管上皮细胞，并蓄积于胞浆内，进而发生毒性作用。另一方面，由于马兜铃内酰胺类成分具有较强的亲电能力，能与DNA碱基环外氨基亲电结合，生成相应的加合产物，直接损伤DNA[15]。

3 结论

本研究利用体外肝微粒体代谢方法结合高效液相色谱-串联质谱技术，建立了马兜铃酸及其体外代谢产物的分析方法。研究表明，马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ在体外肝微粒体代谢中主要发生硝基还原和去甲基反应。其中，由硝基还原反应形成的马兜铃内酰胺类化合物是马兜铃酸产生毒性作用的主要原因，该方法对于阐明马兜铃酸的毒理有重要意义。

[1] XING G Z, QI X M, CHEN M, et al. Comparison of the mutagenicity of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ in the gpt delta transgenic mouse kidney[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2012, 743(1/2): 52-58.

[2] 王潇晗，张连学，部玉钢，等. 含马兜铃酸中药减毒的研究进展[J]. 中草药，2013,44(22):3 241-3 243.

WANG Xiaohan, ZHANG Lianxue, Bu Yugang, et al. Research progress on attenuation of aristolochic acid[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2013, 44(22): 3 241-3 243(in Chinese).

图4 马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的代谢产物的二级质谱图和裂解途径Fig.4 MS2 and fragmentation pathways proposed of metabolites of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ

[3] CHEN L, MEI N, YAO L, et al. Mutations induced by carcinogenic doses of aristolochic acid in kidney of big blue transgenic rats[J]. Toxicology Letters, 2006, 165(3): 250-256.

[4] COSYNS J P, DEHOUX J P, GUIOT Y, et al. Chronic aristolochic acid toxicity in rabbits: a model of Chinese herbs nephropathy?[J]. Kidney International, 2001, 59(6): 2 164-2 173.

[5] LI W, LI R. Rapid determination of aristolochic acids Ⅰ and Ⅱ in some medicinal plants by high-performance liquid chromatography[J]. Chromatographla, 2004, 59: 233-236.

[6] ARLT V M, FERLUGA D, STIBOROVA M, et al. Aristolochic acid arisk factor for Balkan endemic nephropathy-associatedurothelial cancer?[J]. Int J Cancer, 2002, 101(5): 500-502.

[7] BALACHANDRAN P, WEI F, LIN R C, et al. Structure activity relationships of aristolochic acid analogues: toxicity in cultured renal epithelial cells[J]. Kidney International, 2005, 67: 1 797-1 805.

[8] GUO L, WU H Z, YUE H, et al. A novel and specific method for the determination of aristolochic acid-derived DNA adducts in exfoliated urothelial cells by using ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2011, 879(2): 153-158.

[9] MA Y H, XIE W W, TIAN T T, et al. Identification and comparative oridonin metabolism in different species liver microsomes by using UPLC-Triple-TOF-MS/MS and PCA[J]. Analytical Biochemistry, 2016, 511: 61-73.

[10]王广甚，刘晓东，柳晓泉. 药物代谢动力学[M]. 北京：北京工业出版社，2001.

[11]韩凤梅，梁智军，陈勇. 马兜铃酸电喷雾质谱电离规律及其药材指纹图谱[J]. 湖北大学学报：自然科学版，2006,28(1):65-68.

HAN Fengmei, LIANG Zhijun, CHEN Yong. The mass law and the fingerprint of aristolochic acids in Aristolochiae by electrospray ionization ion trap mass spectrometry[J]. Journal of Hubei University: Natural Science, 2006, 28(1): 65-68(in Chinese).

[12]YU J, MA C M, WANG X, et al. Analysis of aristolochic acids, aristololactams and their analoguesusing liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2016, 14(8): 626-640.

[13]CHAN S A, CHEN M J, LIU T Y, et al. Determination of aristolochic acids in medicinal plant andherbal product by liquid chromatography-electrospray-ion trap mass spectrometry[J]. Talanta, 2003, 60(4): 679-685.

[14]STIBOROVA M, FREI E, ARLT V M, et al. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy[J]. Mutation Research, 2008, (658): 55-67.

[15]CHAN W, ZHENG Y F, CAI Z W. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of the DNA adducts of aristolochic acids[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2007, 18(4): 642-650.

Research of Aristolochic Acid Ⅰ, Aristolochic Acid Ⅱ and Their Metabolites in Rat Liver Microsomes Using HPLC-MS/MS

ZHOU Hui1, FU Jia1, CAI Zong-wei2

(1.DepartmentofChemistryandPharmacy,ZhuhaiCollegeofJilinUniversity,Zhuhai519041,China;2.DepartmentofChemistry,HongKongBaptistUniversity,HongKongSAR,China)

Aristolochic acids (AAs), derived from aristolochia plant species, are a mixture of structural-related compounds. Aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ are reported to be the major components that are associated with kidney damage toxicity and carcinogenic mutagenicity toxicity. Since the toxicity mechanism of action of Aristolochic acids are still unclear, it is necessary to develop a sensitive analytical method to facilitate these studies. In this work, a rapid and sensitive method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was applied for the determination of aristolochic acid Ⅰ, aristolochic acid Ⅱ and their major metabolites in samples from in vitro metabolism studies. Aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ were incubated with rat liver microsome S9 fractions under aerobic and anaerobic conditions. The incubation samples were analyzed by HPLC-MS/MS. The obtained results showed that the in vitro metabolic pathways of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ are different. The metabolites of aristolochic acid Ⅰ was detected and characterized as aristolochic acid Ⅰa under aerobic condition and aristololactam Ⅰ under anaerobic condition, respectively; however, in the case of aristolochic acid Ⅱ, the only metabolite of aristolochic acid Ⅱ was identified as aristololactam Ⅱ under the anaerobic condition. Besides, the fragmentation behaviors of aristolochic acid Ⅰ, aristolochic acid Ⅱ and their metabolites in rat liver microsomes S9 fractions were characterized and summarized. The results indicated that the production of aristololactams is the main cause of the toxicity of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ in the metabolism of rat liver microsome S9. This study have a certain significance for better understanding of the toxicity mechanism of action of aristolochic acid Ⅰ and aristolochic acid Ⅱ, as well as for toxicity monitoring of aristolochia plants.

aristolochic acid Ⅰ; aristolochic acid Ⅱ; rat liver S9 fractions; metabolism; high perform liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

2016-03-04;

2016-03-27

国家自然科学基金项目(81403077)；广东省自然科学基金博士启动项目(2014A030310494)资助

周 慧(1982—)，女(汉族)，吉林长春人，副教授，从事质谱分析研究。E-mail: zhouhuimslab@163.com

蔡宗苇(1962—)，男(汉族)，福建福州人，教授，从事质谱分析研究。E-mail: zwcai@hkbu.edu.hk

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0030-07

10.7538/zpxb.2017.38.01.0030