DNA甲基化的植物学意义及其研究方法

李坤怿，袁文娅，王鹏文,通信作者



DNA甲基化的植物学意义及其研究方法

李坤怿1，袁文娅2，王鹏文1,通信作者

（1. 天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384；2. 天津市农作物研究所，天津 300384）

DNA中碱基的化学修饰一直是生命科学领域研究的热点之一。DNA甲基化作为DNA序列的修饰方式，是一种重要的表观遗传机制，能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能，在生命活动中起着重要的作用。对于受到环境胁迫的植物生命体基因表达调控过程中也有DNA甲基化变化的痕迹。本文对植物DNA甲基化的产生机制、功能，DNA甲基化在植物应对逆境胁迫中的作用以及用来分析检测DNA甲基化技术方法的原理特点进行综述，以便更好地理解植物DNA甲基化及其对环境胁迫的响应，为植物抗逆性研究及作物遗传改良提供理论参照。

植物DNA甲基化；基因表达调控；DNA甲基转移酶；生物学功能

DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）提供所需要的甲基，在DNA甲基转移酶的催化作用下使甲基（—CH3）转移到DNA分子中特定碱基上，其中最常见的特定碱基是5-甲基胞嘧啶[1-2]。DNA甲基化属于表观遗传学范畴，是真核细胞基因组在复制及转录后最为常见的一种修饰方式，对于生物生命活动起重要作用。DNA甲基化在调节基因组功能的同时不改变DNA分子碱基序列。植物DNA甲基化可以调控环境胁迫下的基因表达过程：调节植物的生长发育；控制某些特定植物基因沉默；调控某些特定基因表达，保持整个基因组遗传物质稳定性等。植物体可以通过甲基化、去甲基化和从头甲基化作用来调控植物基因表达，当自身不需要的时候不表达，需要的时候就表达，因此可达到在不同环境条件和发育阶段下基因的调控[3]。

DNA甲基化是通过改变染色质结构、DNA构象、DNA稳定性以及DNA与蛋白质之间的相互作用，来调控基因表达。对于植物体而言，环境发生变化会导致一些与之相对应的表观遗传变异。当不同程度的环境压力作用于植物时，表观遗传发生变化会影响植物DNA的构象，进一步改变染色质结构及DNA与蛋白质的相互作用，最终达到调节基因表达的作用[4-5]。研究表明，低温、干旱、盐碱、重金属等人工模拟的非生物胁迫，均可诱导植物基因组中可遗传DNA甲基化发生变异。用NaCl对油菜进行盐胁迫试验，可以使耐盐材料的甲基化水平降低，而盐敏感材料的甲基化水平升高[6]；用不同时长的低温胁迫因素对玉米的幼苗进行试验，可以改变玉米苗期叶片基因组DNA甲基化的模式[7]；用NaCl处理水稻，可以降低盐敏感材料和耐盐的根中甲基化水平，全甲基化比半甲基化水平高[8]；张美善[9]对高粱采用逆境胁迫，可以改变亲本及杂交种基因组DNA甲基化的类型和水平；冯奇志[10]的研究表明，在吉林白城的盐碱土中种植水稻，可以改变水稻的甲基化水平，且可以遗传给后代。综上所述，表观遗传的变异能促进产生遗传变异，丰富了植物的表型多样性和环境适应性，为培育新品种提供了新的方向。

1 DNA甲基化机理

DNA甲基化的过程包含两个重要的形式：维持甲基化和重新甲基化。维持甲基化的过程是甲基化DNA完成复制后形成半甲基化DNA（DNA复制过程不能复制甲基化状态），然后由DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，Dnmt1）根据亲链上甲基化位点对已经完成复制的半甲基化DNA做相应的甲基化修饰，在此过程中，甲基化状态稳定性就由维持甲基化来起作用[11]。重新甲基化是在DNA甲基转移酶3A（DNA methyltrans ferase 3A，Dnmt3a）和DNA甲基转移酶3B（DNA methyltransferase 3B，Dnmt3b）的共同作用下，在无甲基修饰过的DNA位点上进行甲基化修饰的过程[12]。去甲基化包括非特异性去甲基化和特异性去甲基化。在研究体外DNA去甲基化的试验中发现，该过程是在去甲基化酶的作用下利用核苷酸切除和连接步骤而进行的核酸替代过程，并受核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的调节[13]。也有研究认为，去甲基化可能是由糖基化酶或某种多肽以去除甲基的方式进行[14]。在DNA复制的过程中，一些因子结合于DNA上，阻碍了甲基转移酶（transmethylase，MTase）对半甲基化DNA的识别，因此甲基化形式不能被“遗传”，而在不断的传代过程中，原有模板DNA上的甲基化被逐渐“稀释”。

2 DNA甲基化植物生物学功能

2.1 DNA甲基化在基因组的防御中起作用

DNA甲基化对真核生物基因组排列构象有较大影响。在5号碳原子上被甲基修饰过的胞嘧啶可以抑制外来DNA和外源转座子（在基因组中可以通过切割、重新整合方式，从基因组中的一个位置“跳跃”到另一位置的一段可以移动的DNA序列）的转录与表达，从而保护基因组由于非等位基因之间产生的重组和转座所导致的破坏，而且可避免许多由于外源DNA表达引起的病原侵染。在植物体中，阻止有害的转座子表达可以通过甲基化发挥作用。例如拟南芥的基因沉默突变体sgs2、sgs3都比较容易受到病毒感染[14]，正是因为有害的转座子没有受到甲基化作用抑制而得到了表达，才容易被病毒侵染。

2.2 DNA甲基化参与调节植物的正常生长发育

在植物生长过程中，DNA甲基化参与调节其生长发育等很多生物过程，如果甲基化水平过低，就会导致植物生长发育及表型异常[15]。把甘蓝的幼苗经过5-氮杂胞苷（5-azac）处理后，甘蓝幼苗DNA甲基化水平低于正常水平，在生长发育中出现各营养器官的发育不完全，比如植株矮化、叶片变小、结实率降低、果实小而蔫等现象[16]。在烟草和拟南芥中转入可以抑制甲基化酶活性的基因，相对于对照组的DNA甲基化水平明显高于转入反义基因的植株的DNA甲基化水平，另外一个现象是试验组的开花时间较对照组的提前，该研究结果表明，降低DNA甲基化的水平，可以使植物开花提前；转入反义基因的植株和后代植物的生殖器官和营养都产生不同程度的异常，而且DNA甲基化的水平与这种现象成反比[17]。

2.3 DNA甲基化与植物的春化作用

Finnegan等[18]的研究表明，DNA甲基化可以影响植物春化作用的进程，促进植物开花，用5-azac和低温处理都可以使植物早期开花。春化作用是通过使植物基因组的DNA甲基化的水平降低来实现的，去甲基化的程度越高，促进开花的效果越明显；甲基化水平越低，低温春化促进开花的作用越明显。春化作用可以促进开花的原因可能是其可以诱导植物开花的启动子和相关的基因会发生去甲基化表达，然后抑制开花基因的重新甲基化，使开花基因不表达，最终改变植物体的生理生化状态和蛋白的表达情况，从而诱导植物开花[19-20]。

2.4 DNA甲基化可引起转基因沉默

转基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS）是向生物体内导入的外源基因，可以特异性的被相应序列的内源或者外源基因抑制表达的现象，是一种基因调控现象。根据引起沉默的机制可以分为：转录基因沉默和转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[21]。由于可以控制转基因启始的启动子和编码区的甲基化状态，与转基因沉默现象有关，所以DNA甲基化可以影响外源基因活性，从而引起转录基因沉默。DNA甲基化可直接或间接地影响基因表达，前者通过直接干扰DNA与转录活化因子结合，从而达到影响转录过程的效果[22-23]；而后者通过产生有特异性的蛋白质与转录因子竞争甲基化DNA的结合位点，结合后的蛋白质变成多蛋白质的复合体，这个复合体可以改变染色体组蛋白乙酰化，最终达到抑制转录效果。目前鉴定了很多这样的转录阻遏物，其中用于转录抑制已经有4个[24]。

3 DNA甲基化的研究方法

3.1 全基因组DNA甲基化检测方法

3.1.1 SssI甲基转移酶法/甲基化酶温育法

由SssI甲基转移酶（SssI methyltransferase）作为催化剂来催化DNA的 CpG位点从头甲基化，再将3H-S-腺苷甲硫氨酸（3H-SAM）中的甲基转移到基因组DNA CpG位点的非甲基化胞嘧啶上。通过测量没有参加反应的3H-SAM的量，可以检测到基因组DNA的甲基化水平，检测结果中放射性量越多，说明基因组DNA的CpG位点的甲基化水平越低[25]。

SssI和SAM甲基转移酶（SAM methyltrans ferase）的性质不稳定，试验过程中需要设立对照组来降低试验结果的误差。DNA的溶解是否均一是试验成功与否的一个至关重要的因素，因为它会影响到对DNA浓度测定精确程度，实际操作过程中可以先用识别位点中不含CpG序列的限制性内切酶消化待测DNA，再用酚-氯仿抽提，但试验过程中要注意防护同位素。

3.1.2 氯乙醛反应法

氯乙醛反应法是先用氯乙醛与基因组DNA反应，然后用荧光分析法检测DNA甲基化水平。该方法的原理是将基因组DNA用硫酸处理再将其提纯后，将DNA链上的嘌呤用柱色谱或银小心除去；再用亚硫酸处理，此时发生未甲基化的胞嘧啶位点会转化为尿嘧啶；把氯乙醛与处理后的DNA样品一起温育，此时已甲基化的胞嘧啶就会转变为荧光性很强的乙烯胞嘧，就可以用啶荧光分析法来检测[26]。荧光越强表明DNA甲基化水平越高。其中检测成功与否的关键是嘌呤去除的是否完全。该方法的优点是可检测所有生物DNA序列甲基化水平，且仅需要少量下游纯化，因为DNA和氯乙醛自身都是无荧光的。但是此法缺点是用到的氯乙醛有剧毒，而且比较耗时。

3.1.3 免疫学法

单克隆抗体与甲基化的胞嘧啶发生特导性反应称为免疫学法。此法原理是单克隆抗体使用异硫氰酸荧光素标记，然后把固定在二乙氨基乙基（diethyl-aminoethanol，DEAE）薄膜上的DNA样品和标记好的单克隆抗体一起温育，DNA甲基化的水平可通过测定所得的DEAE薄膜上的荧光素强度来反映。DNA甲基化的水平越高，荧光素强度就越高。该方法中抗体的设计关系到结果的高度敏感性和特异性。但是该法只能定量测定单链状态下的甲基化胞嘧啶，而在浓缩染色体上很难可以有这种状态[27]。

3.2 位点特异性DNA甲基化的检测方法

3.2.1 限制性内切酶检测法（Southern Blot）

目前已经发现320余种可以识别特定序列是否被甲基修饰过的限制性内切酶，甲基化敏感的限制性内切酶（MSREs）就是其中一种。这类酶中大多数只能切含有1个甲基化碱基位点，一些可以切半甲基化（双链中只有一条链被甲基化）位点，一些能切全甲基化（双链均被甲基化）位点。但是5-羟甲基胞嘧啶、糖化5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或4-甲基胞嘧啶等由于结构比较相似，所以识别时会难一些[28]。Southern Blot法是目前最普遍通用且基于此原理的方法[29]。此法中的两种酶Ⅱ和Ⅰ，均可识别CCGG序列，可分别用RI/Ⅱ，R I/Ⅰ两种酶组合对DNA进行双酶切。此法优点是只需提供待测样品基因组DNA，不需要知道整个DNA序列以及详细一级结构，就可以对被检基因直接评价以及定量分析甲基化。

在MSREs法基础上，Pogribny等[30]建立了一种更加灵敏的甲基化分子新方法，该方法先进之处在于：切割基因组DNA时用MSREs（如Ⅱ、Ⅰ、和HⅡ），显露出5-G，继而用3H-dCTP进行单链DNA复制延伸，使鸟嘌呤碱基上3H数量直接与已切割完毕剩下的未甲基化 CpG位点成比例相关。在抑癌基因异常甲基化、基因或染色体的印迹分析以及某些遗传疾病诊断中，常常会用到MSREs法以及它的改进方法。这种方法的优点有：灵敏性较高，可以检测到纳克级DNA；具有放射性标记，可以不依赖于完整DNA；不需要DNA甲基化酶反应或PCR扩增就可以检测甲基化。但是这种方法也存在着一些缺点，比如对样品DNA的纯度要求特别高，这个指标对结果分析至关重要，另外主要用酶不同的拓扑异构酶也会与其竞争与DNA的结合位点并形成共价中间产物从而影响酶切反应。这个方法主要缺点是：DNA必须要酶切完全，否则会影响试验结果；如果待检片段中有多处甲基化状态的CpG位点不统一，既有甲基化也有非甲基化，那么对结果将难以得出结论[14，31]。

3.2.2 基因组直接测序法

一直以来，基因组直接测序法是研究DNA甲基化的主要方法，该法主要原理是先用Maxam- Gilbert化学裂解法裂解DNA，然后通过PCR扩增后电泳，通过跑出的电泳条带分析序列。此法的优点是保护5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），可以通过测序胶上缺少对应反应产物的特定条带来鉴定没有被裂解5mC。

3.2.3 甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）分析法

MSAP是以扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术为基础发展而来的，AFLP技术中内切酶Ⅰ被限制性内切酶Ⅱ和Ⅰ替代，Ⅰ酶特异性切割的片段被Ⅱ和Ⅰ酶所识别的5’-CCGG序列代替，其本质是：将AFLP技术中的功能酶和目标条带换成对甲基化特异性的酶和序列5’-CCGG。MSAP主要包括DNA模板制备、双酶切、PCR扩增和电泳检测等步骤。其原理是：采用Ⅱ和Ⅰ酶，对基因DNA进行双酶切，然后加上与之对应的限制性内切酶接头，利用接头序列设计引物，特异性扩增5’-CCGG位点甲基化片段。Ⅱ和Ⅰ可以识别相同位点，但是在DNA甲基化的敏感程度上，Ⅱ和Ⅰ的差别比较大。所以扩增出的结果有不同谱带，可以通过这个现象检测出基因组DNA总甲基化水平，并且区分出全甲基化和半甲基化等状态[32]。

目前，在DNA甲基化研究中，运用比较普遍的方法是MSAP技术，与其他方法相比，MSAP技术有很多优点：在全基因组范围内，可以检测到CCGG 位点胞嘧啶甲基化变化，而且植物中存在CCGG比较广泛；该方法中酶所识别的序列相同，所以可以在不知道待测DNA 序列信息情况下检测；MSAP技术是在AFLP技术基础上发展而来的，使用这种方法时有理论可以依据，实际操作时有可行的操作方法，运用时比较方便。但是这个技术也有一定的局限性，如无法检测非CCGG 位点的胞嘧啶的甲基化[33]。

4 小结

DNA的甲基化修饰普遍存在于植物生长发育整个过程中，是植物通过基因调控生长发育过程的重要手段，因此研究植物生长发育过程中的DNA甲基化有重要意义。DNA甲基化贯穿植物一生，从一粒种子到成熟再到衰老的过程中，它作为一种重要的表观遗传现象，在许多生理活动中方面都发挥着至关重要的作用，且DNA分子的一级结构不会被改变。当甲基化修饰以半甲基化形式标记DNA时参与的生命活动有：控制DNA复制启动和终止，控制DNA复制过程中出现错误然后修正的过程；甲基化修饰可以保证DNA分子结构的稳定，减少不利因子转录，从而确保基因组遗传物质能一代接一代稳定遗传下去；参与调配细胞分化方向，是细胞命运去向的指挥官，从而维持植物正常生长发育。近来有研究表明，不良环境胁迫可以诱导植物基因组产生DNA甲基化状态的变化来适应新的不良环境，有人认为这种可遗传的表型变异可以改良植物的性能，为育种提供了新的途径。DNA甲基化产生和维持的机制以及在植物生命活动中的生物学功能的研究在逐年增加，但是目前DNA甲基化的作用机制尚还不是明确，研究DNA甲基化不够深入，得到的一些结论还不成熟，迫切需要攻破的问题主要有以下几个：①其涉及的信号传递与转导机制，甲基化到底是怎样控制复制的起始，它的作用媒介到底是谁？②植物的全基因组甲基化水平普遍较低，但为什么只有胞嘧啶的甲基化水平却较高？③目前还未知的是，造成基因沉默的源动力是什么？总而言之，深入研究DNA甲基化还有很大的发展空间，如果可以阐明DNA甲基化的作用机理以及在生物体发育的各阶段中DNA甲基化起到的作用，将会为作物遗传改良与新品种的选育提供新的研究方向。

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责任编辑：宗淑萍

Botany Meaning and Research Methods of DNA Methylation

LI Kun-yi1, YUAN Wen-ya2, WANG Peng-wen1,Corresponding Author

（1. College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. Tianjin Crops Research Institute, Tianjin 300384, China）

In recent years, chemical modification in DNA bases has been one of the hottest areas of life science research. DNA methylation as one kind of modification way of DNA sequences, is an important epigenetic mechanism. It can regulate the expression of many vital genes while the base compositions of these genes don’t change, therefore DNA ethylation is very important to the plant’s grow progress. For the plants under environmental stress, the number of DNA methylation had changed during the regulation of gene expression. This paper introduces the mechanisms and biological functions of DNA methylation in plant, and its functions in plant response to environmental stress, and the principle and characteristics of the method for DNA methylation analysis. This would enable us to better understand the methylation of plant DNA and its response to environmental stress, and provide a theoretical reference for plant stress tolerance research and crop genetic improvement.

plant DNA methylation; gene expression and regulation; DNA methyltransferase; biological function

1008-5394（2017）01-0077-06

Q75

A

2016-07-14

天津市农科院院长基金项目“盐胁迫下玉米杂交种与亲本间DNA甲基化差异性分析”（15011）

李坤怿（1992-），男，新疆昌吉人，硕士在读，研究方向：作物遗传育种。E-mail: 845613986@qq.com。

王鹏文（1957-），男，辽宁盖州人，教授，博士，主要从事作物遗传育种方面的研究。E-mail: pengwenw@sina.com。