色氨酸荧光猝灭法测定海带中碘离子

闫爽，王黎颖，王聪，芦尚德，杨佳丽，徐仰仓，2，*

（1.天津科技大学海洋与环境学院，天津300457；2.天津科技大学天津市海洋资源与化学重点实验室，天津300457）

色氨酸荧光猝灭法测定海带中碘离子

闫爽1，王黎颖1，王聪1，芦尚德1，杨佳丽1，徐仰仓1，2，*

（1.天津科技大学海洋与环境学院，天津300457；2.天津科技大学天津市海洋资源与化学重点实验室，天津300457）

研究碘离子对色氨酸的荧光猝灭效应，旨在建立色氨酸荧光猝灭法测定海带中碘离子。在pH=6.0的磷酸缓冲液中，加入不同浓度的碘离子，测定色氨酸溶液的荧光光谱及强度的变化。试验表明，色氨酸具有释放荧光的特性，最佳激发和发射波长分别为223 nm和352 nm。碘离子对色氨酸的荧光具有猝灭作用。色氨酸浓度为10μmol/L时，碘离子对色氨酸的荧光猝灭呈线性关系，根据猝灭程度可计算出碘离子的浓度，该方法的检测限为1.64μmol/L。根据该方法检测了两种海带样品中的碘离子，其浓度为637μg/g干重（Laminaria japonica Aresch）和621μg/g干重（Saccharina japonica）。

荧光猝灭；色氨酸；碘离子

目前，有很多测定碘离子的方法，如离子选择电极法[1-3]、火焰原子吸收法、分光光度法[4-5]、容量法等[6]。这些方法有的选择性、稳定性较差，有的灵敏度低，有的对其他成分的抗干扰能力弱，有的操作复杂、准确度较差。而采用色氨酸荧光猝灭法测定碘离子的分析方法还鲜见文献报道。色氨酸是必需氨基酸的一种，并有较高的荧光特性。本文对色氨酸与碘离子相互作用的荧光光谱进行了研究，发现碘离子与色氨酸在一定的条件下能使色氨酸荧光发生猝灭。据此，经过进一步研究建立了用色氨酸作为荧光试剂测定碘离子的新方法。该方法仪器设备简单、分析成本低、快速、灵敏度高、选择性好，用于测定海带中碘的含量，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；TD20002型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；METTLER TOLEDOFE20型酸度计：上海精密科学仪器有限公司；马弗炉：黑龙江东拓仪器制造有限公司；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

L-色氨酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、碘化钾（分析纯）、乙醇（95%）、氢氧化钾（分析纯）、硫酸（分析纯）。

1.2 方法

1.2.1 色氨酸荧光光谱的考察确定

取4μmol/L的色氨酸溶液，加入荧光石英池中，设定两狭缝都为5.0nm，电压700V，扫描速度1200nm/min；以210 nm为激发波长，在200 nm～900 nm范围内扫描发射光谱，确定最大发射波长λem，再以此发射波长扫描激发光谱，确定最大激发波长λex，重复激发和发射扫描，直至激发和发射峰值不再变化。

1.2.2 不同浓度色氨酸溶液荧光谱性测定

15 mL反应体系。最大发射波长和最大激发波长依据上述测得的结果设定，测定浓度为1、2、3、4、5μmol/L色氨酸溶液的荧光光谱。

1.2.3 色氨酸用量的选择

单因素试验。在15mL体系中，色氨酸溶液5mL，碘化钾溶液10mL，温度25℃，反应时间30min。碘离子浓度梯度为：0、1、2、3μmol/L，控制一个碘离子浓度，改变检测液色氨酸的浓度为5、10、15、20、25、30μmol/L。测定溶液的荧光强度。通过单因素方差分析选择出在低浓度的碘离子（0～3μmol/L）溶液下，对检测液色氨酸荧光影响最大的色氨酸浓度。

1.2.4 方法检测限

测定碘离子含量的标准曲线，建立一元线性回归方程。测定12份试剂空白，根据3S0/K（S0为空白测定值的标准偏差，K为工作曲线的斜率）进行计算，求方法检测限[7]。

1.2.5 样品分析

清洗干净的海带风干至恒重，准确称取1 g（精确至0.000 1 g），剪碎研细，移入坩埚加入1mol/LKOH溶液2mL，充分搅拌，在电炉上碳化10min后，放入马弗炉中600℃下灼烧30min。灰分溶于一定量的蒸馏水中并加热煮沸浸取碘离子，溶液降至常温后，用0.2 mol/L的H2SO4调节至中性，过滤，滤液用蒸馏水定容至1 000mL的容量瓶中，即成待测液。比色管中加入10mL待测液，5mL的10μmol/L的色氨酸，室温下充分振荡后，反应30min，测定荧光强度[8]。

1.2.6 碘量法测定海带中碘离子的含量[9]

先将市售海带洗净、烘干、粉碎。准确称取1.0 g样品于瓷坩埚中，置于电炉上碳化至无烟，然后置入马弗炉中逐渐升温至600℃约30min后取出，样品呈灰白色后取出自然冷却，用50mL水将海带灰置于150mL烧杯中，多次用热水洗涤坩埚内残渣。然后进行过滤并将滤液和洗液移入150 mL锥形瓶中加入2 mL 0.25mol/LNaOH-KMnO4溶液摇匀放置5min，随后加入2mL 0.2mol/L硫酸溶液，边摇动边加入（COOH）2溶液至溶液中高锰酸钾的颜色恰好消失。加入5mL 2%KI溶液，溶液将变为黄色。用0.002mol/LNa2S2O3标准溶液滴定，至溶液呈浅黄色时，加入50mL蒸馏水，再加入2mL 1%淀粉指示剂，摇匀后，继续滴定颜色恰好消失。样品中碘的含量的计算：

式中：21.15=M/6；A为碘的含量，mg/kg；C为Na2S2O3的浓度，mol/L；M为碘的相对原子质量；V为Na2S2O3标准溶液用量，mL；W为海带的质量，g。

2 结果与分析

2.1 色氨酸的荧光光谱

图1是色氨酸的激发光和发射光的扫描图谱。

图1 色氨酸的激发和发射光谱Fig.1 The fluorescence excitation spectra of tryptophan（a）and its emission spectra（b）

从图谱可知，色氨酸有两个激发波长，分别为223 nm和270 nm，发射波长为352 nm，前人[10]也有类似的研究报道。波长越短，能量越大，若分别用223 nm和270 nm的光照射色氨酸时，前者发射的荧光强度要大于后者，这与我们的试验结果相符，说明以223 nm为激发光时，色氨酸发射荧光的灵敏度高于以270 nm为激发光的灵敏度。另外，杨晋等[11]报道，激发光与发射光的波长相差越小，色氨酸的荧光强度越容易受干扰，当二者的差大于90时，色氨酸才能被有效测定。综上所述，我们选择了色氨酸的激发波长223 nm，发射波长352 nm。

2.2 色氨酸浓度对其荧光光谱的影响

图2为不同浓度色氨酸溶液的荧光光谱。

图2 不同浓度色氨酸的荧光光谱Fig.2 Different concentrations of tryptophan fluorescence spectrum

从图2中得出，色氨酸浓度对最大激发和发射波长无明显影响。表明荧光是色氨酸的一种特性。

2.3 色氨酸用量

研究不同浓度色氨酸检测液与碘离子的反应。在15mL体系中，设定荧光仪参数：同步模式，EM Start WL（发射起始波长）223 nm，EM End WL（发射终止波长）400 nm，EMWL（发射波长）352 nm，两狭缝均选5.0 nm，电压：700V，响应时间4.0 s。重新设定合适的量程。表1为不同浓度的色氨酸强度的单因素方差分析表，通过单因素方差分析，10μmol/L色氨酸的p=p（f=29.33）＜0.01，在显著水平α=0.05下不同浓度碘离子溶液（0～3μmol/L）对10μmol/L浓度的色氨酸荧光猝灭效果最强。因此，选择10μmol/L的色氨酸溶液为最佳检测浓度。

表1 不同浓度的色氨酸荧光强度的单因素方差分析Table 1 One-Way ANOVA Analysis of tryptophan fluorescence at different concentrations

2.4 线性范围和方法检测限

2.4.1 荧光法测定碘离子含量的标准曲线

用荧光分光光度法分别测定1μmol/L～5μmol/L碘化钾与10μmol/L的色氨酸反应后溶液的荧光强度，图3为荧光分光光度法测定碘离子含量的标准曲线。标准曲线方程为F0/F=0.038 5[I-]+1.005 7（式中：F0为空白样的荧光强度，即色氨酸溶液的荧光强度；F为添加碘化钾30min后溶液的荧光强度；[I-]为碘离子的浓度），相关系数为0.999 7。线性关系良好。

图3 荧光分光光度法测定碘离子含量的标准曲线Fig.3 The standard curve for the determination of iodine ion content by fluorescence method

2.4.2 空白试验

向12支标记好的比色管中分别加入10mL蒸馏水和5mL的10μmol/L的色氨酸检测液，同上设定荧光分光光度计的相关参数，配置好的空白溶液充分振荡反应30min后，测定出空白实验的的荧光强度F，测定结果见表2。

表2 空白试样的荧光强度Table2 Fluorescence intensity of blank sample

F0=3 955，空白试样的标准偏差为0.021。

方法检测限[7]=3空白标准偏差/斜率=1.64μmol/L。

方法检出限为1.64μmol/L，在线性范围内1.64μmol/L～5μmol/L，可直接用于含碘量高的海产品中碘含量的测定。

空白试验一定程度上可以校正误差，分析误差来源。国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）1997年通过，1998年发表的《分析术语纲要》（IUPAC Compendium of Analytical Nomenclature）中规定：“检出限以浓度（或质量）表示，是指由特定的分析步骤能够合理地检测出的最小分析信号XL求得的最低浓度cL（或质量qL）”。空白值和检出限与整个分析体系有关，即与分析方法、样品制备和测定、环境、仪器及其灵敏度、试剂、分析人员等有关[12]。

色氨酸溶液的荧光强度对环境的敏感性较高，可能是由于影响了吲哚环微环境的变化[13]。根据空白试验结果分析，系统误差可能原因是仪器噪声或实验环境中的噪声影响仪器测量荧光值的波动；色氨酸及碘化钾溶液配制时的仪器误差和人为误差；空气或水中的某些物质可能造成色氨酸荧光强度的变化等。

2.5 海带提取液中碘离子含量测定

实验测定了两种市售海带Laminaria japonica Aresch（L）和Saccharina japonica（S）中碘离子的含量，通过碱碳化法，将海带中的碘离子全部转化为无机碘离子并溶于水溶液中。利用荧光分光光度法测定了海带样品的水溶液与色氨酸检测液反应后的荧光强度。依据标准曲线方程，求出海带样品的水溶液中碘离子浓度，继而计算出海带样品中的碘离子含量，测定结果见表3。

表3 海带样品的碘含量的计算Table3 The calculation of kelp iodine ion content of sample

由表3可知，Laminaria japonica Aresch样品（L）的平均碘含量为637μg/g，Saccharina japonica样品（S）的平均碘含量为621μg/g。

2.6 碘量法测定海带样品中碘离子的含量

准确称取海带按1.2.6处理，然后把其溶液定容于100mL容量瓶中。取20.00mL试液进行平行测定，结果见表4。

表4 碘量法测定海带中碘的含量Table4 Determining of the content of iodine in the kelp-iodim etry

由表4可知，用碘量法测定的Laminaria japonica Aresch样品（L）的平均碘含量为639.72μg/g，Saccharina japonica样品（S）的平均碘含量为622.66μg/g。

3 结论

Fan[14]研究了[Omim]Cl（一种离子化合物，分子式为C12H23N2Cl）与色氨酸反应的荧光特性，结果表明[Omim]Cl对色氨酸的荧光猝灭属于静态猝灭。L-色氨酸与[Omim]Cl中的Cl-之间的反应是自发的，但是作用程度较为微弱，范德华力和氢键是主要结合力。碘与氯属同一主族，在原子半径、得失电子能力等方面呈现一定的规律性。碘化钾与[Omim]Cl一样，也属离子化合物，因此，碘化钾中的I-对色氨酸荧光的猝灭机理与[Omim]Cl的相似，也应属静态猝灭。

在pH=6.0的磷酸缓冲液介质下，碘离子能使色氨酸的荧光猝灭，就此建立了用色氨酸作为荧光试剂测定碘离子的新方法。用该方法测定的两种海带样品中的碘与应用碘量法测定的结果相近。该方法仪器设备简单、分析成本低、快速、灵敏度高、检出限低、选择性好，用于测定海带中碘的含量，结果令人满意。

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Tryptophan Fluorescence Quenching Method for Determination of Iodine in Kelp Ions

YAN Shuang1，WANG Li-ying1，WANG Cong1，LU Shang-de1，YANG Jia-li1，XU Yang-cang1，2，*
（1.College of Marine and Environmental Sciences，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The novelmethod of determining iodide ion content in kelp was established by the reaction of iodide ionquenchingtryptophan fluorescenceintensity.Under phosphate buffer medium at pH=6.0，adding different concentrations of iodide into fluorophore solutions with given concentrations，fluorescence intensives were measured，tried several type of fluorophores，found tryptophan hadcharacteristics of fluorescence releasing.Experiments showedthat the fluorescence optimum excitation spectra of tryptophan and its emission spectra were 223 nm and 352 nm.When the concentration of tryptophan was10μmol/L，the iodide ionhad a liner relation of tryptophan fluorescence quenching.According to the degree of quenching couldcalculate the concentration of the iodide ion，the detection limit was 1.64μmol/L.Two kinds of kelp was tested according to the method.In Laminaria japonica Aresch the concentration of the iodide ion was 637μg/g，and it was 621μg/g in Saccharina japonica.

fluorescence quenching；tryptophane；iodide ions

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.030

2016-05-06

天津市科技兴海项目（KJXH2012-14）；天津市大学生创新创业训练计划项目（201610057085）

闫爽（1991—），女（汉），研究生，研究方向：海洋生物资源利用研究。

*通信作者