玛咖中主要酰胺类化合物的提取工艺优化研究

邵炎，李芸，刘涛

（1.广东药科大学药用生物活性物质研究所，广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006；2.广东药科大学中药学院，广东广州510006）

玛咖中主要酰胺类化合物的提取工艺优化研究

邵炎1，2，李芸1，2，刘涛1，*

（1.广东药科大学药用生物活性物质研究所，广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006；2.广东药科大学中药学院，广东广州510006）

玛咖酰胺类化合物是新资源食品原料玛咖粉中的特征性成分。为了富集玛咖中的玛咖酰胺类单体化合物，首次采用酸碱反应去除脂肪酸类主要干扰杂质，并对提取工艺进行优化。结果表明，超声初提玛咖酰胺的最佳条件为：以乙醚为提取溶剂，料液比1∶30（g/mL），超声时间30min；酸碱反应的最佳条件为：氢氧化钠添加量5.0mL，反应温度50℃和酸碱反应时间50min。在最优条件下，提取物中的玛咖酰胺含量为20.79%，相对于DBS53/001-2015《食品安全地方标准玛咖干制品》中的提取方法，它的相对含量上升了73.9%。

玛咖；玛咖酰胺；脂肪酸；酸碱反应

玛咖（Lepidium meyenii Walp.）为十字花科独行菜属，一年或两年生草本植物，原产于秘鲁海拔3 500m以上安第斯山区，国内于本世纪初引进后主要种植于云南和新疆等地，2011年玛咖粉获批为新资源食品原料。目前玛咖的市场开发和药学研究主要集中在营养价值和整体生物功效上，针对活性组分或单一活性成分所开展的研究较少，特别是被广泛认为是玛咖生物功效的特征活性成份－玛咖酰胺类化合物[1]，玛咖酰胺具有广泛的药用价值，如改善性功能[2-3]、抑制脂肪酸水解酶活性[4-5]、保护神经作用[6]和抗疲劳[7]等。然而，玛咖酰胺类单体化合物在玛咖中含量低、且分离提取效率低，限制了玛咖酰胺药理药效研究和市场应用，本研究旨在探究一种可以有效的富集玛咖酰胺，进而更有效提取玛咖中玛咖酰胺的新方法。

到目前为止，已公开报道的玛咖酰胺类单体化合物已有32种，其中间甲氧基-苄基-亚麻酰胺（图1A），苄基-亚麻酰胺（图1B），间甲氧基-苄基-亚油酰胺（图1C），苄基-亚油酰胺（图1D）和苄基-十六烷酰胺（图1E）所占比例最大。玛咖酰胺理化性质表明它们属于酰胺类生物碱，极性较小，易溶于己烷或氯仿，也可溶于甲醇等有机溶剂中[8-9]。针对这类具有特殊生物活性的酰胺类生物碱，可采取的分离提取方法包括溶剂萃取[10]、超声波提取[11]、柱色谱分离[12-13]、薄层色谱法分析鉴定[14-15]、高效液相色谱法分离分析[16]等，但采用这些提取纯化方法，大部分为分析用途，且活性成分损失比较严重且干扰杂质很难去除。干扰杂质主要包括脂肪酸及其酯类，植物甾醇和其它类的生物碱等，通过氢氧化钠和脂肪酸等物质发生化学反应，形成不溶于有机溶剂的酯类物质，可除去脂肪酸类干扰杂质，提高分离提取玛咖酰胺类化合物的效率。基于此，本研究拟结合酸碱反应优化选择反应条件，去除干扰杂质并富集活性成分，优化玛咖中主要酰胺类化合物的提取工艺，为玛咖的深层次开发和玛咖酰胺的药理药效研究提供提取工艺参考。

图1 5种主要玛咖酰胺的化学结构Fig.1 Chemical structures and names of 5 main macamides

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜玛咖：来源于云南丽江永胜县种植基地；N－苄基－十六碳酰胺标准品：购自中山优诺生物科技发展有限公司；乙腈（色谱纯）：美国霍尼韦尔；氢氧化钠、乙醚、乙醇等：均为分析纯试剂。

DHG-9053A鼓风干燥箱、DZF-6210真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；HH-3A数显恒温三温水浴锅：金坛市精达仪器制造厂；AL104电子天平：梅特勒托利多（上海）有限公司；5810R低温冷冻离心机：德国贝克曼库尔特公司；BILON-S650CT多用途恒温超声波提取器：上海比朗仪器制造有限公司；配有二极管阵列紫外检测器（2998）的液相色谱仪（2695）、UPLC/Q-TOFMS（ESI离子源）液相色谱质谱联用仪：美国沃特世公司；LG18中草药粉碎机：黄岗永安医疗器械公司。

1.2 方法

1.2.1 制备玛咖粉

挑选健康的玛咖鲜果洗净，均匀切片，鼓风干燥箱干燥（40℃，12 h），再经粉碎机粉碎，过40目筛后，用分装袋包装，放置于真空干燥箱中备用。

1.2.2 高效液相检测条件

色谱柱：Waters SunFireTUC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（B）和水（A）；梯度洗脱程序0～10min：50%B～85%B，10min～25min：8 5%B～95% B；流速：1mL/min；液相紫外检测波长：210 nm。

1.2.3 玛咖酰胺的提取工艺

准确称取1.0 g玛咖粉（天平称取1.0 g±0.01 g）于50mL离心管中，加入30mL乙醚后拧紧瓶盖，置于多用途恒温超声波提取器中（40℃，超声时间1.5 s，间隙时间1.0 s，变幅杆Φ6，输出功率50%），超声提取30min，然后4 000 r/min，离心15min。将上清液倒入100mL圆底烧瓶中，旋转蒸干后加入5mL乙醇，充分摇匀溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入5mL氢氧化钠（1 mol/L）后50℃水浴加热50 min，加2 mL碳酸（1 mol/L）中和，将溶液蒸干后加入5 mL正己烷和30 mL纯水超声溶解，萃取取正己烷层，通过高效液相色谱法进行分析和计算含量。

1.2.4 玛咖酰胺提取标准方法（DBS 53/001-2015《食品安全地方标准玛咖干制品》）

样品粉粹，过40目筛，准确称取1.0 g玛咖粉（天平称取1.0 g±0.01 g）于100mL玻璃三角瓶中，加入40mL石油醚后用封口膜封口，置于超声清洗机中超声提取15min（200W，50℃）。超声完成后摇匀，将提取液和玛咖渣一同倒入50mL离心管中，4 000 r/min离心10min。将上清液倒入100mL圆底烧瓶中，旋蒸干后加入4mL乙腈，充分摇匀溶解提取物后吸取至5mL容量瓶，再加0.8mL乙腈至圆底烧瓶摇匀后吸取至上述容量瓶，取适量乙腈定容至5mL。

1.2.5 水分测定

水分采用GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》方法（减压干燥法）进行测定。

1.2.6 玛咖酰胺含量（Y）计算

式中：Y为试样中玛咖酰胺的含量，mg/kg；C为样液中玛咖酰胺的浓度，μg/mL；V为试样提取物定容的正己烷体积，mL；M为试样质量，g；W为试样含水量，g/100 g。

参考云南DBS 53/001-2015《食品安全地方标准玛咖干制品》中的方法，这里把玛咖中5种主要玛咖酰胺的总含量计算为玛咖中玛咖酰胺的总量。采用Excel、Origin 8.0和SPSS等软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 玛咖酰胺的鉴定

样品一为精密配置0.05mg/mLN－苄基－十六碳酰胺标准品的正己烷溶液。样品二为按照前文1.2.3正交优化所得最佳工艺条件，制备得到玛咖酰胺溶液。样品三为按照云南省卫生和计划生育委员会颁布的DBS53/001-2015《食品安全地方标准玛咖干制品》中的标准提取方法得到的溶液。将3组样品溶液稀释10倍，分别进样10μL后，通过高效液相色谱法分析，结果见图2。

图2 玛咖酰胺的紫外色谱图Fig.2 The typical chromatograms of macamides

分别对图2A、图2B色谱图中峰1～3通过质谱正离子模式，进行全扫描分析，检测出峰1包含两种分子离子（[M+H]+，398.275 9和368.253 9）；峰2包含两种分子离子（[M+H]+，400.299 6和370.284 2）；峰3包含一种分子离子（[M+H]+，346.295 2），分别对应着玛咖中5种主要玛咖酰胺类化合物，即间甲氧基-苄基-亚麻酰胺（397.60），苄基-亚麻酰胺（367.57），间甲氧基-苄基-亚油酰胺（399.62），苄基-亚油酰胺（369.59）和苄基-十六烷酰胺（345.57），与玛咖酰胺标准品（图2C）相比，图2A和图2B中峰3保留相近，所以进一步表明本研究的提取方法可以分离出玛咖中特征活性成分。图2A和图2B，在相同质量原料条件下，经过最佳工艺后，5种主要的玛咖酰胺的相对含量也明显上升。

2.2 玛咖酰胺初提取的单因素优化试验

玛咖酰胺初提取的单因素优化试验结果见图3。

图3 超声提取玛咖酰胺的单因素试验Fig.3 Single factor experiments of macamides extracted with ultrasonic

2.2.1 选择最佳的提取溶剂

称取8份玛咖粉样品，每份1.0 g，按极性从大到小的顺序，选择甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正己烷和石油醚作为玛咖的提取溶剂，料液比为1∶30（g/mL），超声提取30min后，离心蒸干，最后每组用正己烷定容5mL。以N－苄基－十六碳酰胺的含量为指标，通过高效液相色谱法计算分析，考察有机溶剂对玛咖酰胺得率的影响，结果见图3A。当乙醚作为提取溶剂时，N－苄基－十六碳酰胺得率最高。

2.2.2 超声提取时间的确定

选定料液比为1∶30（g/mL）、提取溶剂为乙醚，考察超声提取时间（10、20、30、40、50、60min）对N－苄基－十六碳酰胺含量的影响，检测其含量的步骤同上，结果见图3B。N－苄基－十六碳酰胺的含量随着超声时间的延长先升后降，这是由于开始随着超声时间的增加，玛咖中有效成分流开始慢慢流出；但时间过长，提取时间对目标化合物含量影响不大。因此，选择30min作为最佳的超声提取时间。

2.2.3 料液比的确定

称取6份玛咖粉样品，每份1 g，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）分别加入乙醚，检测N－苄基－十六碳酰胺含量的步骤同上，结果见图3C。从折线图中可以看出，随着料液比的增加，N－苄基－十六碳酰胺的含量呈上升趋势，当料液比大于1∶30（g/mL）时，目标化合物得率变化不大，且料液比对玛咖酰胺得率有显著的影响。因此，从实际操作和生产成本等角度考虑最佳的料液比选1∶30（g/mL）。

2.3 酸碱反应条件的单因素试验

酸碱反应条件的单因素试验结果见图4。

图4 酸碱反应的单因素试验Fig.4 Single factor experiment in acid-base reaction

2.3.1 氢氧化钠添加量的确定

称取1.0 g玛咖粉，按最佳的超声提取条件得到提取液，然后以4 000 r/min转速离心15min，蒸干上清液后，用30mL乙醇定容于容量瓶中。平行设定6组试验，每组5.0mL样品溶液，各加入氢氧化钠（1.0mol/L）添加量为（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL），水浴加热温度为40℃，进行50min酸碱反应，结果见图4A。随着氢氧化钠浓度的增加，玛咖酰胺含量显著增加，在添加4.0mL氢氧化钠时，玛咖酰胺总含量最高。当氢氧化钠添加量大于4.0mL时，其含量有下滑的趋势。这可能是因为碱性条件下，玛咖酰胺稳定性下降。综合考虑，选择3.0、4.0、5.0mL作为酸碱反应正交试验氢氧化钠添加量的因素水平。

2.3.2 酸碱反应时间的确定

选定氢氧化钠（1.0mol/L）添加量为4.0mL，水浴加热温度为40℃，考察酸碱反应时间（20、30、40、50、60、70min）对玛咖中玛咖酰胺纯度的影响，结果见图4B。玛咖酰胺的纯度随着时间延长缓慢增加，可能因为随着酸碱反应时间的增加，脂肪酸等杂质与氢氧化钠反应的越充分，其纯度升高，但时间过长，反应达到平衡，其得率变化不大。且随着时间的延长，能耗成本增加。因此，选择40、50、60min作为酸碱反应正交试验的时间因素水平。

2.3.3 水浴加热温度的确定

选定水浴加热的温度为（30、40、50、60、70、80℃），加入4.0mL氢氧化钠，酸碱反应时间为50min，其他条件不变，考察温度对玛咖酰胺总含量的影响，结果如（图4C）。当温度为40℃时，玛咖中玛咖酰胺的纯度最高，随着温度的增加，其含量明显的下降，原因可能是随着温度增加，玛咖酰胺的稳定性下降，另外，也增加的成本。综合考虑，选择30、40、50℃作为酸碱反应正交试验的温度因素水平。

2.4 酸碱反应法提取玛咖酰胺正交试验优化

2.4.1 酸碱反应工艺正交试验

为了进一步优化酸碱反应条件，纯化玛咖酰胺类单体化合物，以氢氧化钠添加量、水浴加热温度和酸碱反应时间为因素，每个因素设立3个水平，以玛咖酰胺的含量为衡量指标，采用L9（34）正交试验设计（表1），分析酸碱反应各因素对玛咖酰胺含量的影响。正交试验结果和方差分析见表2和表3。

从表2可以看出，在酸碱反应的3个影响因素中，影响程度大小依次为A>C>B，即氢氧化钠添加量对玛咖中玛咖酰胺的总含量影响最大，温度的影响最小。最佳酸碱反应工艺参数组合为A3B3C2，即氢氧化钠添加量5.0mL、温度50℃、时间50min。在最佳酸碱反应条件下，咖咖中玛咖酰胺纯度为20.53%。

表1 酸碱反应中正交试验因素水平Table1 The orthogonal experiment factor levels in acid-base reaction

表2 酸碱反应中正交试验结果Table2 Orthogonal experiment results of acid-base reaction

表3 酸碱反应的方差分析Table3 Variance analysis results of acid-base reaction

由表3可知，在影响玛咖中玛咖酰胺纯度的3个因素中，氢氧化钠添加量对玛咖酰胺纯度的影响最为显著，温度的影响最小。

2.4.2 验证试验

按照正交试验分析所得的最佳工艺参数组合，在单因素试验的基础上，以玛咖酰胺提取的工艺步骤，3次重复测定玛咖中玛咖酰胺总含量分别为20.95%、20.75%和20.66%，平均值为20.79%，略高于正交试验的最高得率（20.53%）从而验证了正交试验的结论。经计算，图2A和图2B中玛咖酰胺总含量分别为13.35%和23.21%，相对于DBS 53/001-2015《食品安全地方标准玛咖干制品》中的提取方法，本方法所提取的样品中玛咖酰胺的相对含量上升了73.86%，其中峰1、峰2、峰3所对应的玛咖酰胺单体化合物的含量分别增加203.92%、171.81%和167.05%。通过酸碱反应过后，所得到产物的脂肪酸等杂质含量减少，产品的纯度高，玛咖酰胺类化合物得率提高。

3 研究结论与展望

在本试验设计范围内，通过单因素和正交试验优化，确定了酸碱反应提取玛咖酰胺类化合物的优化工艺参数，即料液比为1∶30（g/mL），最佳的提取溶剂为乙醚，超声提取时间为30min，氢氧化钠（1mol/L）添加量为5.0mL，温度为50℃，反应时间为50min。在最佳的试验条件下，玛咖酰胺的含量为20.79%，相对于DBS53/001-2015《食品安全地方标准玛咖干制品》中的提取方法，其含量上升了73.9%。结果表明，酸碱反应可以有效除去脂肪酸等干扰杂质，有效富集玛咖酰胺类化合物，后继也可通过液相色谱等方法进一步获得玛咖酰胺类单体化合物。

近年来我国玛咖种植和加工产业迅速发展，但同时也伴随着产业盲目扩张，药用价值导向混乱，市场乱象频出的困局。玛咖酰胺这类具有特殊生物功效和潜在市场价值的化合物，除了将其作为玛咖质量评价标准外，通过优化改进现有分离技术，实现玛咖酰胺的有效富集和纯化，有望为玛咖的深度开发和药理药效研究提供更好的样品来源，促进玛咖产业的进一步健康发展和药用价值开发。

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Study on Optimization of Extraction Process of the Main Macamides from Maca（Lepidium meyenii Walp.）

SHAO Yan1，2，LI Yun1，2，LIU Tao1，*
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Institute of Pharmaceutical Bioactive Substances Research，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.School of Chinese Traditional Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Macamides was the active marker compounds of maca powders.Macamides was gathered from maca powders through acid-base reaction firstly，which could remove the main impurities such as fatty acid and so on. Then extraction process was optimized.The preliminary results presented that the optimum conditions of supersonic extraction of macamides as follows：the best extraction solvent was diethyl ether，ratio of material to solvent was 1∶30（g/mL）and time of extraction was 30 min；the optimal acid-base reaction conditions was that reaction temperature of 50℃，the volume of so dium hydroxide of 5.0mL and reaction time of 50 min.Under optimized conditions，the content of the macamides in maca extract could reach to 20.79%，compared with the extraction method in THE MACA DRY PRODUCTS QUALITY STANDARD（DBS 53/001-2015），it increased by 73.9%.

maca；macamides；fatty acid；acid-base reaction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.009

2016-05-13

国家自然科学基金青年基金（21206020）；广东省公益研究与能力建设专项资金（2014A010107027）

邵炎（1990—），男（汉），硕士研究生，研究方向：中药活性成份研究与开发。

*通信作者：刘涛（1981—），男，副研究员，博士。