小黄鱼内脏蛋白的提取及应用研究

吴凯强，姜维，郭健，应知伟，宋文东，*

（1.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022；2.浙江海洋学院创新应用研究院，浙江舟山316022；3.浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山316022）

小黄鱼内脏蛋白的提取及应用研究

吴凯强1，姜维2，郭健1，应知伟3，宋文东2，*

（1.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022；2.浙江海洋学院创新应用研究院，浙江舟山316022；3.浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山316022）

本文以小黄鱼内脏为研究对象，从中分离提取出活性蛋白。通过对缓冲液pH，提取时间，醇液比3个单因素的考察，确定因素水平，并设计正交试验，对工艺进行优化，得出最佳提取工艺。试验结果表明最佳提取工艺为：提取时间5h，缓冲液pH9，醇液比0.8∶1（体积比），在此工艺下所提取的蛋白液浓度为3.409mg/mL。最后，用所提取的活性蛋白进行初步应用性试验，通过美拉德反应，制备食品添加剂，为小黄鱼下脚料的应用提供了理论基础。

小黄鱼；废弃内脏；活性蛋白

小黄鱼[1-2]，拉丁名Pseudosciaena polyactis，又名小鲜、黄花鱼、花色、黄鳞鱼、小春色等，是辐鳍鱼纲，鲈形目，石首鱼科，黄鱼属。它是中国重要的经济鱼类，与大黄鱼、带鱼并称“中国三大海产”。小黄鱼中蛋白质和营养元素含量丰富[3-4]。因此在日常生活中深受人们的喜爱，而在我国南方因大量生产小黄鱼干制品而产生大量的鱼类下脚料[5]，对其有效地利用成为企业可持续发展的关键[6-7]。

随着我国水产品加工行业的发展，水产品废弃物的利用越来越受到重视[8-9]。近年来，国内外众多领域的研究者投入到对此类资源的开发和利用的研究中去，这其中包含了食品专业、医药专业、环境保护专业等[10-12]。

目前，虽然有研究者对小黄鱼的生物习性及分布进行了研究[13-14]，但尚少有研究过小黄鱼内脏中活性蛋白的基本生物学性质以及蛋白的结构性质和遗传学性质等内容，故本文以小黄鱼作为研究对象，用正丁醇优化粗提了小黄鱼内脏的活性蛋白并对其进行一定的应用型研究，从而解决小黄鱼下脚料的闲置浪费问题，为开发一种天然的食品保鲜剂提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所需小黄鱼：舟山临城老碶菜场[鱼身长度（14±5）cm，鱼体重量（30±10）g]；碱性蛋白酶（生化试剂，酶活力>30 000U/g）、木瓜蛋白酶（生化试剂，酶活力>50 000U/g）：国药集团化学试剂有限公司；牛血清蛋白（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为国产分析纯；试验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；PHB-4雷磁便携式pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-1100分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TM-767 II搅拌器、AR124CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；BCD-256KT海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；DGG-9030BD电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；CF16RN台式微量高速离心机：Hitachi Koki Co.Ltd.（JAPAN）。

1.3 方法

1.3.1 主要工艺流程

原料→洗净→匀浆→离心取上清液→正丁醇提取粗蛋白→硫酸铵分级沉淀→透析→粗蛋白定量→酶解→美拉德反应

1.3.2 匀浆液的制备

用剪刀解剖小黄鱼，取内脏，用蒸馏水清洗后称重。将鱼内脏和一定pH值的磷酸盐缓冲液，按质量体积比为1 g/3mL加入到高速匀浆机中匀浆；取出后4℃下静置40min；冷冻离心取上清液，置于4℃冰箱内备用。

1.3.3 标准曲线的绘制

准确称取牛血清白蛋白100mg，置于100mL的容量瓶中，用蒸馏水充分溶解，定容至刻度线，静置，备用。得到浓度为1mg/mL的标准蛋白溶液。

取9支试管，用移液枪分别准确移取标准蛋白质溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，加水稀释至10mL，涡流混匀，用紫外分光光度计在波长280 nm处测量吸光值。

1.3.4 单因素试验的考察

取适量小黄鱼内脏和pH分别为5、6、7、8、9的磷酸盐缓冲液进行匀浆。取出后静置40min；离心取上清液。分别量取各个pH值下所得的匀浆上清液20mL，分别加入正丁醇12、16、20、24、28mL，搅拌均匀后，在4℃下分别静置2、3、4、5、6 h后，冷冻离心，收集上清液。

离心所得的上清液用饱和度为20%～50%的硫酸铵分级沉淀法，提取上清液中的活性蛋白后，透析脱盐24 h，即得小黄鱼活性蛋白提取液。采用紫外分光法在波长为280 nm处测量吸光值。

1.3.5 正交试验设计

根据单因素试验结果，选取缓冲液pH值为7、8、9，提取时间为3、4、5 h，醇液比为0.6∶1、0.8∶1、1∶1（体积比）。对缓冲液pH值、提取时间、醇液比3个因素进行考察，通过L9（34）正交表进行正交试验，以粗提液中的蛋白质含量为考察标准，探讨优化小黄鱼内脏活性蛋白的工艺条件，正交水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table1 Factor levels orthogonal experiment

1.3.6 一种新型的食品添加剂的粗制备

1.3.6.1 酶解原料的制备

制备最佳工艺条件下的活性蛋白液100mL，在50℃下，pH为7时加入0.5 g的木瓜蛋白酶和0.5 g的碱性蛋白酶反应5 h后，在90℃灭酶20min，冷却后在8 000 r/min下离心20min，倾出酶解液，置于4℃冰箱内备用。

1.3.6.2 美拉德反应

准确称取50mL的稀释若干倍木糖母液和50mL的蛋白酶解液，充分搅拌后，用10%NaOH调节pH至8；将溶液倒入250mL的蒸馏烧瓶中，在100℃下分别蒸馏2 h；冷却后，使用紫外分光光度计，在波长为490 nm处测量吸光值。美拉德反应的程度由反应后溶液的吸光度值作为依据，以未反应的溶液作为参比溶液，测量美拉德反应后溶液在波长490nm处的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的测定及绘制

牛血清蛋白标准曲线如图1所示。

图1 牛血清蛋白标准曲线Fig.1 The standard curve of Bovine serum albumin

根据图1得到牛血清蛋白标准线性方程：y= 0.652 4x-0.005 4，相关系数R2=0.999 3。由标准曲线方程，可进行关于提取量的定量，计算公式如下：

式中：m表示提取量，mg；y表示透析液的蛋白浓度，mg/mL。

2.2 缓冲液的pH值对活性蛋白提取量的影响

不同缓冲液pH值对蛋白浓度的影响如图2所示。

图2 不同缓冲液pH值对蛋白浓度的影响Fig.2 The influence of different buffer pH value on the protein concentration

由图2可知，当缓冲液pH在5～9之间逐渐增加时，活性蛋白提取液的浓度是呈先增后减的趋势。当pH为8时，所测的提取液浓度是最高的。由此可见，缓冲液pH值的酸性太强，或碱性太高都会导致活性蛋白的失活，影响活性蛋白的提取量，因此当pH为8时，活性蛋白的提取量最高。

2.3 提取时间对活性蛋白提取量的影响

不同提取时间对蛋白浓度的影响如图3所示。

由图3可知，在提取时间为2 h～6 h时，随着提取时间的逐渐增加，活性蛋白提取液的浓度先增后减。在4 h时，活性蛋白提取液的浓度是最高的。低于4 h，由于蛋白浆液中的活性蛋白没有被充分提取出来，而导致提取液浓度过低。而高于4 h，由于提取时间过长，活性蛋白中存在的一些蛋白酶可能会分解蛋白质，而出现蛋白自溶的现象。另外，提取环境的不稳定，也可能会导致在长时间下，一些活性蛋白的失活，而影响活性蛋白提取液的浓度。因此，当提取时间为4 h时，活性蛋白的提取量最高。

图3 不同提取时间对蛋白浓度的影响Fig.3 The influence of different extraction time on the protein concentration

2.4 醇液比对活性蛋白提取量的影响

不同醇液比对蛋白浓度的影响如图4所示。

图4 不同醇液比对蛋白浓度的影响Fig.4 Different alcohol liquid ratio on the protein concentration

由图4可知，在醇液比在0.6∶1～1.4∶1时，随着醇液比的增加，活性蛋白提取液的浓度先增后减。在醇液比为0.8∶1（体积比）时，活性蛋白提取液的浓度达到最大。醇液比较少时，由于无法完全提取出蛋白浆液中的蛋白，会导致提取液的蛋白浓度过低。由于丙酮、正丁醇等此类的有机溶剂容易使蛋白质等生物大分子变性失活，所以整个试验操作必须在低温下进行。而过量的提取剂，就会导致蛋白浆液中有机溶剂分子过多，使部分蛋白质出现变性失活现象。因此，当醇液比为0.8∶1（体积比）时，活性蛋白的提取量最高。

2.5 正交试验考查结果

在单因素试验的基础上，采用正交试验对美拉德反应条件进行优化，结果与分析见表2，方差分析见表3。

由表2可知，对美拉德反应程度影响的主次关系为B>A>C，即提取时间>缓冲液pH>醇液比，根据正交试验得到的最佳条件为A3B3C2，即pH为9，提取时间为5 h，醇液比为0.8∶1（体积比）。在此最佳反应条件下进行验证试验，得到蛋白浓度为3.409mg/mL，说明此时蛋白浓度最高。由表3可知，缓冲液的pH，醇液比对结果影响显著。

表2 正交试验结果Table2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table3 The analysis of variance

2.6 美拉德反应结果分析

根据木糖母液美拉德反应结果可知，平均的吸光值达到0.749，说明样品中存在挥发性酯类成分，可进行进一步的分离提纯去鉴别分析，为木糖母液以及小黄鱼下脚料综合应用去生成一种新型的食品添加剂提供了理论参考。

3 结论与讨论

本次试验设计了一种新的提取工艺，从小黄鱼的内脏中提取出活性蛋白。这是目前在小黄鱼研究方面还没有出现过新方法。整个蛋白提取试验虽然没有采用色谱柱分离或凝胶过滤法等高新技术进行分离，但试验内容合理严谨，多次单因素试验和正交试验，最终优化了内脏活性蛋白的提取工艺，得到较高的提取量。

试验结果表明，本试验中设计的提取工艺，最佳工艺条件是提取时间为5 h，缓冲液pH为9，醇液比为0.8∶1（体积比），通过正交试验验证得出由此可以看出，此提取工艺稳定，效果好，应用性强。另外，本论文中对所提取活性蛋白的应用，也进行了尝试性试验。通过美拉德反应，研究出了一种新型食品添加剂[15-17]。这也为进一步开发利用该资源提供了有益的参考和科学参考。

如今，随着人口的增长，人们越来越依靠海洋资源。中国水产品的产量持续上升迎合了市场的需求，但这也带来了大量水产废弃物，如果能对这些水产废弃物的开发利用进一步研究，会有更大的前景和市场潜力可以被开发出来。目前，有许多国家都正在致力于开发研究各种水产品废弃物的利用，前景十分地被看好。

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Study on Purification of Protease from Pseudosciaena polyactis Offal and Its Application

WU Kai-qiang1，JIANG Wei2，GUO Jian1，YING Zhi-wei3，SONG Wen-dong2，*
（1.College of Food and Medical，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China；2.Innovative Application Research Institute，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China；3.College of Marine Science and Technology，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，Zhejiang，China）

The small yellow croaker visceral as the research object，designing the extraction process，separating and extracting the active protein from the small yellow croaker visceral.Determining the factor level through the investigation of three single factor，buffer pH，extraction time and alcohol liquid，to optimize the process and obtain the best extraction process by designing the orthogonal experimental L9（33）.The results showed that：5 h of extraction time，9 of buffer pH，0.8∶1（volume ratio）of alcohol liquid ratio made the best extraction，in this process the extracted an average of3.409 mg/mL.Finally，with the extraction of active protein applied experiments，through maillard reaction，the preparation of food additives，provides theoretical basis for the application of small yellow croaker scraps.

Pseudosciaena polyactis；fish offa；active protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.012

2015-12-31

舟山市科技计划项目（2014C11009）；浙江海洋学院科研启动项目（21025011013）

吴凯强（1991—），男（汉），在读硕士，研究方向：海洋资源高值化利用研究。

*通信作者:宋文东（1960—），男，教授，博士，研究方向：海洋资源高值化利用研究