LC-MS/MS法研究黄瓜中克百威和甲萘威的消解动态

丁葵英，许文娟，郭礼强，王振刚，孙军

（1.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊261041；2.潍坊医学院附属医院，山东潍坊261031）

LC-MS/MS法研究黄瓜中克百威和甲萘威的消解动态

丁葵英1，许文娟1，郭礼强1，王振刚2，孙军1

（1.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊261041；2.潍坊医学院附属医院，山东潍坊261031）

本文建立的黄瓜果实和叶子中克百威和甲萘威残留量检测的高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），方法的准确度和精密度均能满足国内外农药残留限量检测的要求。采用该方法研究了黄瓜果实和叶子中克百威和甲萘威的消解动态行为，结果表明克百威和甲萘威在叶子上的残留量远大于在果实上的残留量，且在叶子上的消解速率稍慢于在黄瓜果实上的速度，两者的消解动态均符合一级动力学模型。采摘时黄瓜果实上的克百威和甲萘威两种化合物的残留量皆低于国际限量。本研究的数据对分析和预测不同时期蔬菜中农药残留量和使用安全具有重要的意义。

克百威；甲萘威；黄瓜；动态行为；数学模型；液相色谱-串联质谱法

克百威为杂环甲基氨基甲酸酯类农药，甲萘威为萘基氨基甲酸酯类化合物农药，两者皆为广谱高效的杀虫剂，能防治多种作物上的害虫和线虫，在农业生产中得到广泛应用[1]，但由于两者在作物和环境中残效期长、毒性持久，极易造成农产品中残留超标和环境安全问题[2]。因此，各国对两类农药在植物产品中的残留量制定了严格的限量标准，我国对两类农药在蔬菜中的残留限量为：甲萘威1.0mg/kg，克百威0.2mg/kg[3]。

近年来，国内外对克百威和甲萘威残留量检测方法的研究较多。较早有免疫分析法[4]、高效液相色谱法[5-7]、气相色谱法[8]、气相色谱-质谱法[9-10]，近年来逐渐发展起来的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[11-12]、荧光偏振免疫法（FPIA）[13]等，LC-MS/MS因其灵敏度高、定量准确等优势成为克百威和甲萘威残留检测中最常用的方法。克百威在海水和土壤中的降解动力学研究[14-15]，以及甲萘威在土壤中的降解动力学和毒理学及环境归趋研究[16-17]虽已有开展，但对于蔬菜中两者的动力学研究还鲜见报道。黄瓜食用方便，富含维生素A、C以及蛋白质、脂肪、粗纤维、抗坏血酸和钙、磷、铁、镁等多种有益矿物质，是我国的主宰蔬菜作物之一，研究农药在黄瓜中的残留动态学，可分析和预测不同时期黄瓜中农药的残留量，对于食用安全具有重要的意义；同时建立数学模型对政府监管和指导农民合理用药具有重要意义，对于控制农药环境污染也具有重要作用。

本文采用小面积大田试验，一次施药多次采样测定的方式，采用灵敏度高和定量准确的LC-MS/MS法测定黄瓜和叶子中两者的残留量，研究了克百威和甲萘威在黄瓜果实和叶子中的残留动态行为，并建立了数学模型，推导出相关系数、半衰期和残留期（按照国际限量要求的0.01mg/kg）等，为克百威和甲萘威的在黄瓜及类似蔬菜上的安全使用提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乙腈、甲醇（均为色谱纯）：美国Fisher公司；甲酸（色谱纯）：美国Tedia；无水硫酸镁（分析纯）：天津市光复精细化工研究所，用前在500℃马弗炉内烘5 h，200℃时取出冷却备用；石墨炭黑粉、C18和氨丙基粉：均购于Agela Technologies inc公司。

农药：3%克百威颗粒剂、甲萘威为98%的原药；克百威和甲萘威标准品：均购于美国Sigma-Aldrich Laborchemikalien Gmbh公司，纯度均>95%。

1.2 仪器设备及应用条件

1.2.1 仪器设备

Agilent6430液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）：美国Agilent公司；AE 163电子天平：瑞士Mettler公司；T25均质器、MS3 basic涡流混匀器：德国IKA公司；GM 200碾磨仪：德国RETSCH公司；Eppendof 5810R离心机：德国Eppendof公司；N-EVAP 111氮吹仪：美国Organomation公司。

1.2.2 仪器条件

液相色谱条件：流动相A：0.1%甲酸水（体积比）溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0min～3.0min流动相B由20%变化到95%，保持4min，然后在0.1min内由95%B线性下降到20%B，保持3.0min，以平衡色谱柱；流速为0.3mL/min，运行时间10min；色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18柱（100mm×2.1mm，3.5μm）；柱温35℃，进样量5μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子（ESI+）模式；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压4 500 V；毛细管电压：4 000 V；干燥气（N2）流速为：10 L/min，温度300℃，其他参数见表1。

表1 2种农药的质谱分析参数Table1 MS paramaters for 2 pesticides

1.3 方法

1.3.1 大田试验

将试验地点设立在山东省潍坊市昌乐县，土壤pH值为5.6～6.8；供试作物为夏季黄瓜。在黄瓜生长中后期，选择黄瓜长势均匀地势平整的30m2～50m2地块作为试验小区，将该类固体原药按推荐使用量（90 g/hm2～150 g/hm2）先用乙醇溶解，然后用水稀释2 500倍，用工农-16型背负式手动喷雾器在植株表面均匀喷雾1次，施药后的0（喷药后1 h）、1、2、3、5、7、10、13、15、18 d分别采集叶片和果实样品，采样期间严禁喷施其它农药。黄瓜叶片取样方法为植株上、中、下、左、右5点共取样500 g～1 000 g；黄瓜果实取样方法为多点随机取样500g～1 000g样品采集后放入惰性包装物及时带回实验室，尽快测定其中克百威和甲萘威残留量。

1.3.2 残留量检测试验

把黄瓜果实样品切成丁，黄瓜叶子样品粉碎，四分法缩分至不少于500 g试样，装入清洁容器内，加封后标明标记备用。准确称取15.00 g上述样品至100mL离心管中，依次加入6 g无水硫酸镁，15 mL正己烷饱和的乙腈提取试剂，于高速分散机上充分均质，离心10min（10 000 r/min），取上清液3mL于盛有50mg石墨炭黑粉、200mgC18和150mg氨丙基粉10mL玻璃试管中，涡混2min，静止分层后取2mL上清液于另一干净玻璃试管中，氮气吹干，用1mL初始流动相（V乙腈∶V水为20∶80）溶解，用一次性注射器吸取上述溶液，过0.2μm的滤膜，上机待用。每个样品做平行检测样3个，取平均值进行进一步研究。

1.3.3 标准溶液的配制

将克百威和甲萘威标准品用乙腈分别配制成浓度为100μg/mL标准储备液，于4℃冰箱中冷藏保存；用0.08、0.14、0.20μg/mL质量浓度的基质匹配标准溶液，用于绘制标准工作曲线。

1.3.4 稳定性试验

将取来的黄瓜阳性样品1 000 g粉碎、混匀，分别装在20个100mL的塑料离心管中，每管中盛有15 g样品，将盛有样品的离心管置于4℃的冰箱中避光冷藏保存，每次测定时只取其中的一个离心管，分别在0、1、2、3、5、7、10、15、18 d时测定，为计算方便，以试剂标准计算测定值。

2 结果与分析

2.1 方法的线性、定量限和精密度

在方法确定的条件下，为消除基质效应，配制0.005、0.02、0.04、0.08、0.14、0.20μg/mL质量浓度的基质混合标准工作溶液，按1.2.2确定的条件，采用外标法定量，以两种化合物定量离子的峰面积对质量浓度做标准曲线，得到两种农药的回归方程及相关系数（r2），见表2。结果显示：2种化合物在0.005μg/mL～0.2μg/mL范围内线性关系良好，r2均大于0.990，如样品中含量超过该线性范围，要将样品稀释或浓缩。以10倍信噪比计算方法的定量限（LOQ），结果见表2。

表2 两种农药的线性方程、相关系数（r2）和定量限（LOQ）Table2 Liner equations，correlation coefficients（r2）and LOQ of 2 pesticides

取阴性黄瓜样品，分别添加2种化合物混合标准溶液，使其浓度为0.002、0.004、0.02mg/kg，按方法确定的提取、净化和检测步骤，每个添加浓度取8个平行样，计算各农药的平均回收率和相对标准偏差，以考察方法的准确度和精密度。结果表明：在上述3个添加水平中，甲萘威的平均回收率为94.6%～107.5%；克百威的平均回收率为71.7%～95.8%，相对标准偏差分别为2.0%～4.9%和5.8%～7.9%，满足国内外残留限量检测和本文中动力学研究的要求。

2.2 样品稳定性考察

将不同时间测定的黄瓜果实和黄瓜叶子阳性样品含量的结果作对比，这里为了计算方便，以试剂标准计算测定值。结果表明，在黄瓜果实7天之内测定值基本变化不大，在第10天时克百威测定值稍有降低，甲萘威变化不大，但在第15天时化合物的测定值都有明显降低；黄瓜叶子样品中两种化合物相对较为稳定，在第10天时基本稳定不变，但在第15天时两者测定含量有所降低，所以为保证测定结果的准确性，取样后应在7天之内及时测定，以免影响测定结果的准确性。

2.3 克百威和甲萘威在黄瓜果实中的动力学分析

以施药至采样间隔期（简称“采样时间”，d）为横轴，克百威和甲萘威在黄瓜果实中残留量浓度（mg/kg）为纵轴作曲线，得到图1。

图1 黄瓜果实中克百威和甲萘威浓度随时间的变化Fig.1 Concentrations of carbofuran and carbaryl in cucumber fruit on different days

由图1知：黄瓜中克百威和甲萘威的残留量随着时间延长消解非常快，无增加趋势，这是因为黄瓜喷洒到植株上，药物来源只是喷洒在植株上的原药，在代谢过程中无其他持续药物来源，所以只存在消解动态，其残留量和消解率随时间的变化如表3所示。

表3 甲萘威和克百威在黄瓜果实中的消解动态Table3 Dynamic equation of carbaryl and carbofuran in cucumber fruit

由表3可知：这2种化合物消解率较快，2天之内都消解90%以上，这可能主要是夏季温度较高，促使各化合物消解较快。由于两种化合物的结构不同，残留在黄瓜果实上的量不同，由表3知，2天之后各化合物的含量皆在0.01mg/kg的国际限量以下。这表明在夏季，环境温度较高时，克百威和甲萘威不能在黄瓜上形成持久残留，喷洒该类农药后，较短时间内黄瓜果实即可采摘。

2.4 克百威和甲萘威在黄瓜叶子中的动力学分析

同样以施药至采样时间为横轴，克百威和甲萘威在黄瓜叶子中残留量浓度（mg/kg）为纵轴作曲线，得到图2。

图2 黄瓜叶子中克百威和甲萘威浓度随时间的变化Fig.2 Concentrations of carbofuran and carbaryl in cucumber leaves on different days

由图2知：克百威和甲萘威在黄瓜叶子上的变化与在黄瓜果实中的趋势基本相同，但由于黄瓜叶子具有典型的异面叶，发达的栅栏组织，叶面积较大，所以对两种农药化合物吸附能力较强，致使两者在叶子上的残留量较大，消解速度相对在黄瓜果实中也较慢。

甲萘威和克百威在黄瓜叶子中的消解动态见表4。

由表4知：甲萘威在开始时在叶子上的残留量达到了5.233mg/kg，3天时消解率超过50%，18天后叶子上的残留量仍为0.154mg/kg；克百威开始时残留量为0.858mg/kg，2天后消解率达到了70.2%。两种化合物在黄瓜叶子上的消解行为不同，这可能与其结构式有关，甲萘威结构中具有刚性的萘环结构，性质稳定；克百威为杂环甲基结构，性质不够稳定。

2.5 甲萘威和克百威化合物在黄瓜中数学模型的建立

农药在植物体中的消解受到多种因素的影响，包括温度、光照、水分和初始浓度等[18]，各因素对残留动态的综合影响可用某种数学模型进行模拟。目前，可用于预测农药在蔬菜中消解的数学模型很多，如指数函数、多项式回归分析、Rayleigh动态模型、阻滞动力学模型等[19-20]。为研究克百威和甲萘威在黄瓜中的消解动态，选用前三类数学模型利用origin 8.0软件分别模拟两者在黄瓜和叶子上的消解动态，找到最佳描述黄瓜消解动态特征的数学模型。拟合结果如表5所示。

表4 甲萘威和克百威在黄瓜叶子中的消解动态Table4 Dynamic equation of carbaryl and carbofuran in cucumber leaves

表5 黄瓜果实和叶子中甲萘威和克百威的消解动态方程Table5 Dynamic equations of carbaryl and carbofuran in cucumber fruits and leaves

由表5知：甲萘威和克百威在黄瓜果实和叶子上的动态学在3种动力学模型中都更好的符合一级动力学模型，相关系数都在0.90以上；多项式回归模型也可描述两者在叶子上动态模型，相关系数也达到0.90以上，但Rayleigh动态模型不适合描述黄瓜中两种农药的动力学行为。选取相关系数较高的模型计算其半衰期和各化合物的残留期，其结果如表5所示。由表5知：甲萘威在黄瓜上的半衰期和残留期都要长于克百威，这可能是因为甲萘威含有刚硬的萘结构。黄瓜果实上两者的残留期分别为3.4 d和1.4 d，黄瓜从开花到采摘一般在10 d～18 d，所以如果在黄瓜上喷洒此类农药一定要尽早，以免采摘时在黄瓜上具有农药残留；在叶子上的半衰期和残留期较在黄瓜上要长，特别是甲萘威在叶子上的残留期为39.4 d，所以在黄瓜秧拔掉后最好不要喂养牲畜，以免通过生物链到达人体，造成中毒事件的发生，所以研究农药在黄瓜叶子中的消解行为具有重要的意义。

3 结论

本文建立黄瓜中克百威和甲萘威残留量检测的液相色谱-串联质谱法，研究两种化合物在黄瓜中的消解动态行为。于果实10 cm时将两种农药一次性喷洒在植株上，定期取样检测，对测定的数据进行一级动力学方程、多项式回归和Rayleigh动态模型进行模拟。结果表明：黄瓜中甲萘威和克百威在0.005μg/mL～ 0.2μg/mL范围内基质标准线性关系良好，平均回收率分别为94.6%～107.5%和71.7%～95.8%，相对标准偏差为2.0%～4.9%和5.8%～7.9%；分别对二者在黄瓜果实和叶子上的消解数据进行一级动力学方程、多项式回归和Rayleigh动态模拟，结果显示所有过程均更好的符合一级动力学方程。甲萘威在黄瓜和叶子上的方程分别为：c=211.7e(-0.9t)和c=5 480.0e(-0.16t)，相关系数（r2）为0.97和0.93；克百威在黄瓜和叶子上的方程分别为：c=69.18e(-1.39t)和c=859.44e(-0.61t)，r2为0.99和1.0。甲萘威和克百威在果实上的半衰期为3.4 d和1.4 d；叶子上的半衰期为39.4 d和7.3 d。甲萘威和克百威在黄瓜果实采摘时最终残留量小于国际限量要求的0.01mg/kg，而叶子上的最终残留量分别为：0.154mg/kg和0mg/kg。本文为甲萘威和克百威在蔬菜中的残留动态行为研究和安全使用提供了理论依据。

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Degradation Dynamics of Carbaryl and Carbofuran in Cucumber by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

DING Kui-ying1，XU Wen-juan1，GUO Li-qiang1，WANG Zhen-gang2，SUN Jun1
（1.Weifang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，Shandong，China；2.Affiliated Hospital，Weifang Medical University，Weifang 261031，Shandong，China）

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for the detection of carbofuran and carbaryl residues in cucumber fruits and leaves，the accuracy and precision of the method meet the detecting demands for pesticide.The dynamic behaviors of carbofuran and carbaryl residues were studied，showing that both carbaryl and carbofuran residues decreased in cucumber fruits and leaves with the first-order kinetic equations，and the degradation rates of carbofuran and carbaryl in leaves slower than that in fruits，leading to residues in leaves were much higher than that in fruits.Final residues of carbaryl and carbofuran in fruits were both lower than 0.001mg/kg，under the limitation requirement.This study provided theoretical basis for prediction of carbaryl and carbofuran residues and their safe uses in vegetables.

carbofuran；carbaryl；cucumber；dynamic behavior；mathematical model；liquid chromatography -tandem mass spectrometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.032

2016-05-20

山东出入境检验检疫局项目（SK201420）；潍坊市科学技术发展项目（2015ZJ1101）

丁葵英（1982—），女（汉），工程师，硕士，主要从事食品中农兽药残留检测研究。