重组头孢菌素C酰化酶的固定化研究

朱琳琳，常雁红*，姚 舜，罗 晖，于慧敏，沈忠耀

(1.北京科技大学环境工程系，北京 100083；2.北京科技大学生物科学与工程系， 北京 100083；3.清华大学化学工程系，北京 100084)

表1

粗酶液纯化结果

Tab.1

重组头孢菌素C酰化酶的固定化研究

朱琳琳1，常雁红1*，姚 舜1，罗 晖2，于慧敏3，沈忠耀3

(1.北京科技大学环境工程系，北京 100083；2.北京科技大学生物科学与工程系， 北京 100083；3.清华大学化学工程系，北京 100084)

将含头孢菌素C(CPC)酰化酶的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50 L发酵罐中发酵，发酵液OD600可达19.5，酶活达到11 542 U·L-1；CPC酰化酶粗酶液经1%活性炭纯化后，比酶活由6.56 U·mg-1提高到10.77 U·mg-1；然后将纯化的CPC酰化酶共价结合固定在氨基载体LX-1000HA和环氧基载体LX-1000EPC上，并对固定化酶的热稳定性及pH值稳定性进行考察。结果表明，LX-1000HA固定化酶的初始酶活较LX-1000EPC固定化酶低，但其热稳定性、pH值稳定性以及酶与载体的结合强度均高于LX-1000EPC固定化酶；并且在固定化酶投加量相同时，LX-1000HA固定化酶的催化性能优于LX-1000EPC固定化酶。对LX-1000HA固定化酶进行催化批次实验，在催化39批次时达到半衰期。

重组；头孢菌素C酰化酶；固定化酶；稳定性；生物催化

头孢菌素类抗生素是一类高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素，是世界上最畅销的抗感染药物之一[1]。7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是合成头孢菌素的重要中间体，一般由头孢菌素C(CPC)通过化学法或酶法催化制得。CPC酰化酶是一种能直接水解CPC的侧链一步生成7-ACA的生物酶[2]，在7-ACA工业生产中具有非常重要的应用，近年来得到了快速发展[3-5]。由于游离酶存在反应条件苛刻、稳定性差、易失活、不能重复使用等缺点，限制了其在实际工程中的应用，而固定化酶因稳定性好、易分离、可重复利用等优点备受人们青睐[6-7]。 因此，作者将含CPC酰化酶的重组大肠杆菌E．coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50L发酵罐中发酵，经纯化后获得活性较高的CPC酰化酶，进而将其固定在不同载体上得到固定化CPC酰化酶，并对其性能进行考察，以期得到性能优良的固定化CPC酰化酶，为7-ACA工业生产提供参考。

1 实验

1.1 菌种与试剂

CPC酰化酶重组菌种E．coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy，参照文献[8]构建，自行保存。

CPC钠盐、7-ACA，河北石家庄九派集团；环氧基载体LX-1000EPC、氨基载体LX-1000HA，西安蓝晓科技有限公司；高效液相色谱用流动相试剂为色谱纯；活性炭(颗粒)及其它试剂为分析纯；BCA法测蛋白试剂盒、蛋白质marker，上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 CPC酰化酶的分离纯化

1.2.1 菌种发酵

将保存的菌种E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy接种到含有50 mg·L-1卡那霉素的LB培养基中活化。接种量为1%，37 ℃、160 r·min-1摇床培养12 h。

将上述菌种培养液以2.5%的接种量接种至50 L发酵罐中进行培养。发酵培养基(g·L-1)：玉米浆50，酵母粉10，甘油5，NH4Cl 2.5，KH2PO42.3，K2HPO4·2H2O 21.5，乳糖3，用1 mol·L-1的NaOH溶液调pH值至7.5。发酵条件：28 ℃，搅拌速度300 r·min-1，通气量2 m3·h-1，料液体积30 L，发酵时间24 h。发酵期间定时取样，测定生物量(OD600)和酶活。

1.2.2 酶的分离纯化

活性炭具有高度发达的孔隙结构和很大的比表面积，化学稳定性好，耐酸碱，不溶于水和有机溶剂，能经受水浸及高温高压的作用，失效后可以再生，所以常作为吸附剂被广泛应用。除了作为常规的吸附剂吸附有色物质外，活性炭还可吸附小分子蛋白[9]。因此，本实验采用活性炭对CPC酰化酶粗酶液进行纯化。由于活性炭可能对分子量为86 kDa的CPC酰化酶有非特异性吸附，因此应选择合适的活性炭添加量。本实验选择活性炭添加量分别为粗酶液的0.5%、1%和3%。

将收集的菌体用pH值8.5的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(PB)洗涤2次，再用该缓冲液重悬。用高压匀浆机(BIOTECH-50BSG型)在800 bar压强下匀浆3次得到破碎菌液，离心，取上清(即粗酶液)，分别加入0.5%、1%和3%的经水洗的活性炭，在摇床中于25 ℃、160 r·min-1振荡1 h，离心，取上清，即得CPC酰化酶纯化酶液，测定其酶活和蛋白浓度。

1.3 CPC酰化酶的固定化

1.3.1 氨基载体LX-1000HA的活化

将10 g LX-1000HA载体加到40 mL 0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液中，用1 mol·L-1NaOH溶液调pH值至7.8～8.2，于25 ℃摇床振荡15 min后测pH值，再调pH值为7.8～8.2，重复上述步骤，直至振荡后溶液pH值稳定在7.8～8.2。然后加入40 mL 2%(体积分数)的戊二醛(用0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液配制)，25 ℃搅拌1 h，过滤，再用去离子水洗涤3次。由于醛基稳定性较差，载体活化后需立即使用。

1.3.2 固定化酶的制备

LX-1000EPC固定化酶的制备：称取一定量用0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液洗涤过的LX-1000EPC载体置于锥形瓶中，按300 U·g-1的投加量加入CPC酰化酶纯化酶液；根据所加入的酶液的体积，加入2倍酶液体积的1.25 mol·L-1pH值8.0的PB溶液，用1 mol·L-1NaOH溶液调体系pH值至8.0；在25 ℃、160 r·min-1摇床固定化24 h；抽滤，用大量去离子水、0.1 mol·L-1pH值8.5的PB溶液依次洗涤；抽滤，即得LX-1000EPC固定化酶，4 ℃保存。

LX-1000HA固定化酶的制备：取活化的LX-1000HA载体按上述方法固定化20 h，即得。

1.4 CPC酰化酶酶活测定

采用比色法测定游离CPC酰化酶酶活[10-11]：用0.1 mol·L-1pH值8.5的PB溶液配制20 mg·mL-1的CPC溶液，并用1 mol·L-1NaOH溶液调节pH值至8.5。取20 μL CPC酰化酶纯化酶液加到20 μL经37 ℃预热的20 mg·mL-1CPC溶液中，吹打均匀，于37 ℃水浴放置5 min后加入200 μL终止液(50 mmol·L-1的NaOH溶液与20%的醋酸溶液按1∶2的体积比混合)，吹打均匀。将上述混合液于12 000 r·min-1离心3 min，取上清200 μL加入40 μL质量浓度为0.5%的显色液[对二甲氨基苯甲醛(PDAB)的甲醇溶液]，室温显色10 min后测定OD415。

游离酶的酶活定义：在37 ℃、pH值8.5、底物浓度一定的条件下，每分钟催化CPC生成1 μmol 7-ACA所需的酶量定义为1个酶活力单位。

固定化CPC酰化酶(以下简称固定化酶)酶活测定方法及酶活定义与游离酶相同。

1.5 固定化酶性质的测定

1.5.1 固定化酶的热稳定性

将固定化酶加到20 mmol·L-1pH值8.0的PB溶液中，在50 ℃温育不同时间，定时测定固定化酶酶活，计算残余酶活(以零时刻初始酶活值为100%的相对酶活，下同)。

1.5.2 固定化酶的pH值稳定性

将固定化酶置于pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的20 mmol·L-1PB溶液中，25 ℃下温育不同时间，定时测定固定化酶酶活，计算残余酶活。

1.5.3 酶与载体的结合强度

十二烷基磺酸钠(SDS)与蛋白质的疏水部分结合会破坏其折叠结构，形成稳定的SDS-蛋白质复合物。用2%的SDS溶液处理固定化酶，取上清进行蛋白质电泳[12]，考察CPC酰化酶与LX-1000HA载体和LX-1000EPC载体的结合强度。

1.6 固定化酶催化性能评价与反应批次

固定化酶的催化反应器为搅拌釜反应器[13]。具体操作如下：按8 U·mL-1投加量加入固定化酶，通循环冷却水预热到25 ℃，加入已预热的25 mg·mL-1CPC溶液，同时开始搅拌，催化产物经高效液相色谱分析，考察固定化酶对底物CPC生成7-ACA的催化性能。通过自动电位滴定仪滴加2 mol·L-1的氨水保证反应体系pH值为8.5，采用夹套中的循环水调节反应体系的温度。当底物CPC转化率达到95%时，即认为一批反应结束。用去离子水清洗固定化酶并投入下一批催化反应中。

色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18(4.6 mm×150 mm)，流动相为15%甲醇-7.5%乙腈-1%乙酸，流速为0.8 mL·min-1，检测波长为254 nm。

2 结果与讨论

2.1 重组菌的发酵

50 L发酵罐中CPC酰化酶重组菌的生长曲线和CPC酰化酶酶活变化曲线如图1所示。

图1 50 L发酵罐中重组菌的生长曲线和酶活变化曲线

由图1可知，在整个发酵过程中，菌体浓度一直呈上升趋势，发酵26 h时的OD600达到19.5；酶活随着发酵时间的延长而升高，发酵24 h时的酶活达到11 542 U·L-1，继续延长发酵时间，酶活仅略有升高。表明，CPC酰化酶重组菌具有较好的发酵特性。此外，由于本发酵过程采用了乳糖自动诱导的发酵培养基，CPC酰化酶的酶活与菌体浓度保持了较好的一致性，有利于进一步通过提高菌体浓度来提高酶活。

2.2 酶的纯化

CPC酰化酶粗酶液的纯化结果如表1所示。

表1

粗酶液纯化结果

Tab.1

Purification results of crude enzyme solution

由表1可知，CPC酰化酶粗酶液中加入活性炭后，蛋白浓度下降，表明活性炭可能吸附了CPC酰化酶粗酶液中的某些小分子杂蛋白，导致其蛋白浓度下降。对于蛋白浓度为1.07 mg·mL-1的粗酶液，采用1%活性炭对其进行纯化，效果较好，纯化后的蛋白浓度为0.60 mg·mL-1，比酶活可达到10.77 U·mg-1，酶活收率达到92.0%。表明，用少量的活性炭纯化CPC酰化酶粗酶液时，可以很好地吸附小分子杂蛋白，且对CPC酰化酶酶活的影响较小。

CPC酰化酶粗酶液纯化的SDS-PAGE图谱如图2所示。

1.粗酶液 2.蛋白质marker 3.0.5%活性炭纯化 4.1%活性炭纯化 5.3%活性炭纯化

由图2可以看出，粗酶液目的蛋白由α亚基(28 kDa)与β亚基(58 kDa)组成(泳道1)；加入活性炭后，蛋白条带明显减少(泳道3、4、5)，表明不同用量活性炭对CPC酰化酶均有一定的纯化作用，活性炭纯化是一种较简单可行的方法。

2.3 固定化酶性质考察

采用1.3.2方法制得的LX-1000EPC固定化酶和LX-1000HA固定化酶的酶活分别为86 U·g-1和55 U·g-1，酶活收率分别为29%和18%。本实验以游离酶为参照，研究了这2种固定化酶的热稳定性与pH值稳定性，同时对酶与载体的结合强度进行了考察。

2.3.1 热稳定性

LX-1000HA固定化酶、LX-1000EPC固定化酶及游离酶的热稳定性如图3所示。

由图3可知，固定化酶的热稳定性远远高于游离

图3 固定化酶和游离酶的热稳定性(50 ℃)

酶的热稳定性。50 ℃下放置1 h，LX-1000HA固定化酶残余酶活为72%，LX-1000EPC固定化酶残余酶活为40%，而游离酶残余酶活仅5%。固定化酶的酶活与固定化方向、结合位点及结合力有关[14]。虽然LX-1000HA固定化酶的初始酶活(55 U·g-1)低于LX-1000EPC固定化酶(86 U·g-1)，但LX-1000EPC固定化酶中酶与载体的结合力主要为共价结合力，而LX-1000HA固定化酶除了酶与载体之间的共价结合力外，还存在载体(带正电)与酶分子(带负电)间的静电引力，因此LX-1000HA固定化酶中酶与载体的综合结合力可能大于LX-1000EPC固定化酶，这也许是LX-1000HA固定化酶热稳定性高于LX-1000EPC固定化酶的主要原因。

2.3.2 pH值稳定性

LX-1000HA固定化酶、LX-1000EPC固定化酶及游离酶的pH值稳定性如图4所示。

图4 固定化酶和游离酶的pH值稳定性

由图4可以看出，游离酶的最佳pH值为8.0，放置1 d后的残余酶活为65%，放置1.5 d后的残余酶活为50%；LX-1000HA固定化酶在pH值9.0溶液中显示出较高的稳定性，放置3 d后的残余酶活为95%，放置7 d后的残余酶活为90%；LX-1000EPC固定化酶在pH值8.0溶液中显示出较高的稳定性，放置3 d后的残余酶活为55%，放置7 d后的残余酶活为52%。表明，固定化酶的pH值稳定性高于游离酶，其中LX-1000HA固定化酶具有更高的pH值稳定性。

2.3.3 酶与载体的结合强度

CPC酰化酶由一个α亚基和一个β亚基构成，并且α亚基和β亚基之间没有二硫键。因此，CPC酰化酶在不同载体上的结合强度可以通过SDS解吸实验进行评价[15]，结果如图5所示。

1.粗酶液 2.LX-1000EPC固定化酶 3.蛋白质marker 4.LX-1000HA固定化酶

从图5可以看出，LX-1000HA固定化酶较LX-1000EPC固定化酶具有更高的稳定性。对于LX-1000HA固定化酶，CPC酰化酶的α亚基和β亚基都未被洗脱下来，表明CPC酰化酶的α亚基和β亚基都可以与LX-1000HA载体进行多点共价交联，结合紧密；对于LX-1000EPC固定化酶，CPC酰化酶的β亚基被洗脱下来，而α亚基没有，表明CPC酰化酶中只有α亚基可以与LX-1000EPC载体共价交联，β亚基结合强度较低。这可能是因为，CPC酰化酶分子中含有赖氨酸的数量和分布对于其与LX-1000EPC载体的结合有着至关重要的作用[16-17]，α亚基(28 kDa)含有6个赖氨酸和1个具有较高反应活性的N端氨基，而β亚基(58 kDa)只含有2个赖氨酸，并且其中一个被包裹于内部，因此酶分子的β亚基往往不能与LX-1000EPC载体形成稳定的共价键而较易被SDS洗脱下来。此结果也从侧面说明赖氨酸数量多少、分布是否均匀将会影响固定化酶中酶与载体的结合强度[18]。

2.4 固定化酶催化性能评价

2.4.1 固定化酶的催化性能

在25 ℃、pH值8.5的条件下，按8 U·mL-1投加固定化酶，考察固定化酶对底物CPC生成7-ACA的催化性能，结果见图6。

图6 LX-1000HA固定化酶和LX-1000EPC 固定化酶的催化性能

由图6可以看出，对于LX-1000HA固定化酶，反应初始阶段催化速率很快，反应20 min时的CPC转化率已达到86%，7-ACA收率为85%；反应40 min时的CPC转化率达到99%，7-ACA收率为97%。对于LX-1000EPC固定化酶，反应20 min时的CPC转化率为76%，7-ACA收率为74%；而当CPC转化率达到97%，7-ACA收率为96%时，反应需要60 min。表明，在相同的催化条件下，LX-1000HA固定化酶的催化性能优于LX-1000EPC固定化酶。这可能是由于，不同载体具有不同的物理和化学性质(如孔径、疏水性、亲水性以及表面化学性质)，对酶的附着会有影响，进而影响酶的固定化和固定化酶的催化性能[14]。

2.4.2 固定化酶的催化稳定性

大多数情况下，固定化酶的稳定性随着温度的降低而升高，但是温度太低又会影响其催化反应速度[19]，因此本实验对25 ℃下LX-1000HA固定化酶的反应批次进行考察，结果见图7。

图7 LX-1000HA固定化酶的13批次催化反应结果

由图7可以看出，随着反应批次的增加，催化反应时间逐渐延长。这是因为，随着反应批次的增加，固定化酶的酶活逐渐下降，因此需要延长反应时间以保证CPC的转化率。

对13批次催化反应数据进行拟合，推算出反应39批次时达到LX-1000HA固定化酶的半衰期，此时LX-1000HA固定化酶催化反应所需时间为第1批次反应时间的2倍。而Zhu等[13]在25 ℃下进行LX-1000EPC固定化酶的催化反应，固定化酶的半衰期为24批次。表明，LX-1000HA固定化酶的反应批次较LX-1000EPC固定化酶提高了62.5%，LX-1000HA固定化酶具有更高的催化稳定性，这对于7-ACA的一步酶法生产技术的完善及日后的产业化应用具有重要意义。

3 结论

将含头孢菌素C(CPC)酰化酶的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50 L发酵罐中发酵，发酵液OD600可达19.5，酶活达到11 542 U·L-1；CPC酰化酶粗酶液经1%活性炭纯化后，比酶活由6.56 U·mg-1提高到10.77 U·mg-1；然后将纯化的CPC酰化酶共价结合固定在氨基载体LX-1000HA和环氧基载体LX-1000EPC上，并对固定化酶的热稳定性及pH值稳定性进行考察。结果表明，LX-1000HA固定化酶的初始酶活较LX-1000EPC固定化酶低，但其热稳定性、pH值稳定性以及酶与载体的结合强度均高于LX-1000EPC固定化酶；并且在固定化酶投加量相同时，LX-1000HA固定化酶的催化性能优于LX-1000EPC固定化酶。对LX-1000HA固定化酶进行催化批次实验，在催化39批次时达到半衰期，提高了酶的重复利用率，获得了性能优良的固定化CPC酰化酶，对于7-ACA的一步酶法生产技术的完善及日后的产业化应用具有重要意义。

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Immobilization of Recombinant Cephalosporin C Acylase

ZHU Lin-lin1,CHANG Yan-hong1*,YAO Shun1,LUO Hui2,YU Hui-min3,SHEN Zhong-yao3

(1.DepartmentofEnvironmentalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China;2.DepartmentofBiologicalScienceandEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China; 3.DepartmentofChemicalEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)

Inthispaper,therecombinantE.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcywhichcontainscephalosporinC(CPC)acylasewasfermentedina50Lfermentor.WhentheOD600valueofthebrothandtheenzymeactivityreached19.5and11 542U·L-1,respectively.Crudeenzymesolutionwaspurifiedby1%activatedcarbons,andthespecificenzymeactivityincreasedfrom6.56U·mg-1to10.77U·mg-1.ThenthepurifiedCPCacylasewasimmobilizedonLX-1000HA(aminocarrier)andLX-1000EPC(epoxycarrier)bycovalentbinding,andthethermalstabilityandpHvaluestabilityoftheimmobilizedenzymewereinvestigated.TheresultsshowedthattheinitialenzymeactivityofLX-1000HAimmobilizedenzymewaslowerthanthatofLX-1000EPCimmobilizedenzyme,whileitsthermalstability,pHvaluestability,andbindingstrengthofLX-1000HAimmobilizedenzymeandcarrierwerebetterthanthoseofLX-1000EPCimmobilizedenzyme.CatalyticperformanceofLX-1000HAimmobilizedenzymewasbetterthanthatofLX-1000EPCimmobilizedenzymeforthesameenzymedosage.Thehalf-lifeofLX-1000HAimmobilizedenzymewasabout39cyclesundersuchcatalyticreactionconditions.

recombination;cephalosporinCacylase;immobilizedenzyme;stability;biocatalysis

国家自然科学基金资助项目(21276023，21476025)，北京市自然科学基金资助项目(2143041)，中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(FRF-SD-12-007A)

2016-09-18

朱琳琳(1990-)，女，山东泰安人，硕士研究生，研究方向：环境微生物、固定化酶及其应用，E-mail：780284613@qq.com；通讯作者：常雁红，副教授。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.02.005

TQ 465.1 Q 556

A

1672-5425(2017)02-0019-06

朱琳琳，常雁红，姚舜，等.重组头孢菌素C酰化酶的固定化研究[J].化学与生物工程，2017，34(2)：19-24.