RP-HPLC法同时测定人血浆中丙戊酸钠及其代谢产物的浓度Δ

张玲敏，谢 娟，李龙宽，廖荣华，邱钟燕（.贵州医科大学基础医学院，贵阳 55000；2.贵州省人民医院药剂科，贵阳 550002；.贵州医科大学第三附属医院药剂科，贵阳 558000；.贵州省人民医院儿科，贵阳550002）

RP-HPLC法同时测定人血浆中丙戊酸钠及其代谢产物的浓度Δ

张玲敏1＊，谢 娟2#，李龙宽3，廖荣华1，邱钟燕4（1.贵州医科大学基础医学院，贵阳 550004；2.贵州省人民医院药剂科，贵阳 550002；3.贵州医科大学第三附属医院药剂科，贵阳 558000；4.贵州省人民医院儿科，贵阳550002）

目的：建立同时测定人血浆中丙戊酸钠（VPA）及其代谢产物2-丙基-2-戊烯酸（2-ene-VPA）浓度的方法。方法：血浆样品经环己烷沉淀蛋白后，用2，4′-二溴苯乙酮进行衍生化，以正辛酸为内标，采用反相高效液相色谱法测定。色谱柱为Zorbax SB-C18，流动相为乙腈-水（65∶35，V/V），流速为1 mL/min，柱温为35⑥，紫外检测波长为258 nm，进样量为20 μL。结果：VPA、2-ene-VPA血药浓度分别在5.0～200.0、0.5～20.0 μg/mL范围内线性关系良好（r均为0.999 9，n＝5），定量下限分别为5.0、0.5 μg/mL；日内、日间RSD均小于5%，方法回收率分别为95.99%～98.80%、97.40%～98.17%，提取回收率分别为80.46%～86.23%、80.45%～85.61%。采用该法测得10例癫痫患儿VPA血药浓度为27.4～93.2 μg/mL，2-ene-VPA血药浓度为0.85～3.94 μg/mL。结论：该方法操作简便、专属性强，可用于VPA血药浓度检测及药动学研究。

丙戊酸钠；2-丙基-2-戊烯酸；反相高效液相色谱法；衍生化；血药浓度

丙戊酸钠（Sodium valproate，VPA）是临床上治疗单纯或复杂失神发作、肌阵挛发作、全身强直阵挛发作的一线广谱抗癫痫药，其有效治疗浓度为50～100 μg/mL[1]。由于其给药剂量与血药浓度呈非线性动力学关系[1-2]，且治疗窗窄、个体差异大，故需进行血药浓度监测以及时调整患者个体化给药方案，从而保证治疗效果、减少药品不良反应的发生[3-4]。VPA主要经3条途径代谢，其中由线粒体β氧化代谢途径生成的2-丙基-2-戊烯酸（2-Propyl-2-pentenoic acid，2-ene-VPA）被认为是比VPA抗癫痫及镇静作用更强的物质，但可能存在损伤神经系统和肝脏的风险[5-6]。由于2-ene-VPA的半衰期长且可通过血脑屏障，故怀疑其可能与患者服用VPA所致的头晕、嗜睡、脑水肿、长时间昏迷、神经毒性和VPA脑病等不良反应相关[7]。有研究者采用高效液相色谱（HPLC）法测定2-ene-VPA的血药浓度，或采用气质联用（GCMS）法同时测定VPA和2-ene-VPA的血药浓度[1，8]。在此基础上，本研究建立了同时测定VPA和2-ene-VPA血药浓度的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，以期为VPA及其代谢产物的药动学研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；TGL-16C型高速台式离心机（上海梅香仪器有限公司，离心半径为5.1 cm）；SC-3610型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，离心半径为16.0 cm）；SMARTN15UV型纯水仪（上海康雷分析仪器有限公司）；TDA-8002型水浴锅（河北省黄骅航天仪器厂）；AL204型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；XH-B型漩涡混合器（姜堰市康健医疗器具有限公司）。

1.2 药品与试剂

VPA对照品（大连美仑生物技术有限公司，批号：J1115AS，纯度≥99%）；2-ene-VPA对照品（加拿大Toronto Research Chemicals，批号：5-JHY-61-1，纯度≥98%）；正辛酸对照品[内标，生工生物工程（上海）有限公司，批号：SJ1211S0513J，纯度：＞99%]；2，4′-二溴苯乙酮（衍生化试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：19703，纯度：＞98%）；乙腈为色谱纯，三乙胺为分析纯，水为超纯水；空白血浆由贵州省人民医院中心实验室提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（65∶35，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：35⑥，进样器温度：20⑥；紫外检测波长：258 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 VPA标准工作液 精密称取VPA对照品100 mg，用甲醇溶解并稀释，得质量浓度为10 mg/mL的VPA贮备液，于－20⑥冰箱中保存。临用前用甲醇稀释成质量浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、5 mg/mL的VPA标准工作液，备用。

2.2.2 2-ene-VPA标准工作液 精密称取2-ene-VPA对照品5 mg，用甲醇溶解并稀释，得质量浓度为5 mg/mL的2-ene-VPA贮备液，于－20⑥冰箱中保存。临用前用甲醇稀释成质量浓度分别为12.5、25、50、100、200、400、500 μg/mL的2-ene-VPA标准工作液，备用。

2.2.3 内标溶液 精密称取内标对照品100 mg，用甲醇溶解并稀释，得质量浓度为1 mg/mL的内标贮备液，于－20⑥冰箱中保存。临用前用甲醇稀释成质量浓度为100 μg/mL的内标溶液。

2.2.4 衍生化试剂 精密称取2，4′-二溴苯乙酮500 mg至50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得质量浓度为10 mg/mL的衍生化试剂，于4⑥密封保存。

2.3 血浆样品处理

取血浆样品250 μL，加入内标溶液10 μL和2 mol/L硫酸10 μL，涡旋混匀2 min，加入环己烷1 mL，涡旋混匀10 min，以转速16 000 r/min高速离心10 min。吸取全部上清液置于2 mL EP管中，分别加入衍生化试剂和三乙胺各50 μL，混匀，于70⑥下以氮气流挥干，残渣用乙腈200 μL复溶，加入衍生化试剂10 μL和三乙胺3 μL，涡旋混匀，置于80⑥水浴中反应30 min，加乙腈至总体积为200 μL，混匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液20 μL进样分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 在“2.1”项色谱条件下，2-ene-VPA、VPA与内源性物质分离良好，2-ene-VPA、VPA和内标的保留时间分别为11.5、14.3、15.2 min，详见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.2 标准曲线绘制与定量下限考察 取空白血浆、相应质量浓度VPA标准工作液和2-ene-VPA标准工作液各适量，分别配制成VPA质量浓度为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、200.0 μg/mL，2-ene-VPA质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg/mL的血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理后，以“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以待测物质量浓度（x）为横坐标、待测物与内标的峰面积比值（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程分别为yVPA＝0.224 5xVPA+0.192 5（r＝0.999 9，n＝5），y2-ene-VPA＝0.292 0 x2-ene-VPA+0.150 2（r＝0.999 9，n＝5）。结果表明，VPA和2-ene-VPA血药浓度分别在5.0～200.0、0.5～20.0 μg/mL范围内线性关系良好，定量下限分别为5.0、0.5 μg/mL（信噪比＞5）[9]。

2.4.3 精密度与准确度试验 分别配制VPA低、中、高质量浓度（10.0、40.0、160.0 μg/mL）和2-ene-VPA低、中、高质量浓度（1.0、4.0、16.0 μg/mL）的血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理后，进样分析，各样品重复测定5次，连续测定5 d，考察日内、日间精密度；以实测质量浓度与理论质量浓度比较，计算方法回收率，考察方法准确度。结果显示，VPA各质量浓度血浆样品日内RSD为1.66%～4.11%，日间RSD为1.05%～2.95%，方法回收率为95.99%～98.80%；2-ene-VPA各质量浓度血浆样品日内RSD为2.04%～4.70%，日间RSD为0.25%～1.03%，方法回收率为97.40%～98.17%。精密度与准确度试验结果见表1。

表1 精密度与准确度试验结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

表1 精密度与准确度试验结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

待测物 理论质量浓度，μg/mL方法回收率，% VPA 2-ene-VPA 10．0 40．0 160．0 1．0 4．0 16．0日内精密度实测质量浓度，μg/mL 9．65±0．16 38．40±1．58 156．16±4．88 0．97±0．05 3．92±0．08 15．55±0．37 RSD，% 1．66 4．11 3．13 4．70 2．04 2．38日间精密度实测质量浓度，μg/mL 9．66±0．25 38．62±1．14 158．08±1．66 0．97±0．01 3．93±0．01 15．63±0．14 RSD，% 2．59 2．95 1．05 1．03 0．25 0．90 96．55 95．99 98．80 97．40 98．17 97．67

2.4.4 提取回收率试验 分别配制VPA低、中、高质量浓度（10.0、40.0、160.0 μg/mL）和2-ene-VPA低、中、高质量浓度（1.0、4.0、16.0 μg/mL）的血浆样品各5份，按“2.3”项下方法处理后，进样分析，得色谱峰面积A；空白血浆经4倍体积环己烷萃取后，取上清液，分别加入相应质量浓度VPA、2-ene-VPA的标准工作液各适量，使最终质量浓度与前者相对应，按“2.3”项下方法处理后，进样分析，得色谱峰面积B，计算提取回收率（A/B×100%）。结果显示，VPA各质量浓度血浆样品的提取回收率分别为86.23%、82.81%和80.46%，2-ene-VPA各质量浓度血浆样品的提取回收率分别为80.45%、82.22%和85.61%，内标的提取回收率为81.83%。

2.4.5 稳定性试验 分别配制VPA低、中、高质量浓度（10.0、40.0、160.0 μg/mL）和2-ene-VPA低、中、高质量浓度（1.0、4.0、16.0 μg/mL）的血浆样品各5份，分别考察其在室温放置0、6、12、24 h，反复冻融3次，－80②冰冻放置0、10、30 d的稳定性。结果显示，在上述条件下，VPA各质量浓度血浆样品的回收率为97.04%～100.65%、95.04%～98.83%、95.04%～100.79%，2-ene-VPA各质量浓度血浆样品的回收率为94.55%～101.63%、97.40%～100.97%、95.15%～100.24%，RSD＜5%，表明血浆样品稳定性良好。

2.5 临床应用血药浓度监测

采用上述RP-HPLC法测定10例癫痫患儿血浆中VPA和2-ene-VPA的浓度。选择以VPA治疗2个月以上的患儿，于末次给药后次日晨起静脉采血2 mL，经乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝后，以转速3 000 r/min低速离心5 min，取上清液按“2.3”项下方法处理后，进样分析。结果显示，10例癫痫患儿VPA血药浓度为27.4～93.2 μg/ mL；2-ene-VPA的血药浓度为0.85～3.94 μg/mL，其中有1例患儿的血药浓度低于定量下限，详见表2。

表2 10例癫痫患儿VPA和2-ene-VPA血药浓度Tab 2 Plasma concentrations of VPA and 2-ene-VPA in 10 epileptic children

3 讨论

VPA是含有8个碳的短链脂肪酸，因其没有可产生紫外吸收光谱的结构，用HPLC法难以直接测定[10]。本研究以2，4′-二溴苯乙酮作为衍生化试剂，对VPA和2-ene-VPA进行衍生化，使其携带紫外特征吸收基团，能够在紫外光下被检测。通过二极管阵列检测器扫描，最终确定其最大吸收波长为258 nm，且该波长下待测物与内标分离良好，内源性物质对其测定无明显干扰。

在内标物质的筛选中，笔者分别考察了庚酸、正辛酸和壬酸。结果显示，庚酸的保留时间较短，且与杂质峰重合；壬酸保留时间过长，不利于临床大样本的监测；而正辛酸保留时间适中，且与待测物、内源性杂质的分离良好，故最终选择正辛酸作为内标。

据文献报道，血浆样品的处理一般采用溶剂萃取法和沉淀法[9]，本研究对这两种方法进行了比较。结果表明，采用乙腈为蛋白沉淀剂处理血浆样品，低质量浓度样品未能检出[11]，故最终选用提取回收率更高的溶剂萃取法。在对萃取溶剂的筛选中，笔者比较了常用萃取溶剂乙酸乙酯、环己烷和石油醚[6，11]，最后选择了提取效率较高的环己烷作为萃取溶剂，其提取回收率＞80%，符合生物样品定量分析的基本要求[9]。在复溶溶剂的选择中，本研究先选用甲醇作为复溶溶剂，但溶解效率并不高，代谢产物2-ene-VPA未能出峰；当选用乙腈作为复溶溶剂后，反应效率提高，低质量浓度待测物亦可被检出，这可能与乙腈为非质子性溶剂、衍生化物在其中能更好地溶解有关，故最终选用乙腈为复溶溶剂。

参照文献[12]对流动相进行筛选。结果显示，以甲醇-水作为流动相，未能检出2-ene-VPA，其原因可能与待测物质量浓度较低或与其在甲醇中的溶解度不佳有关；选用非质子性溶剂乙腈组成流动相，当乙腈-水比例为65∶35（V/V）时，待测物与内标峰形良好，且与内源性物质分离完全，故选为乙腈-水（65∶35，V/V）作为流动相。

将该法用于检测10例癫痫患儿体内VPA的血药浓度。结果显示，其体内VPA的血药浓度为27.4～93.2 μg/mL，有3例患儿的血药浓度低于有效治疗浓度（50～100 μg/mL）；2-ene-VPA的血药浓度为0.85～3.94 μg/mL，其中1例患儿的血药浓度低于定量下限，可能与药物代谢的个体差异及联合用药有关。

本研究采用衍生化试剂对待测物结构进行修饰，建立了同时测定人血浆中VPA和2-ene-VPA浓度的RPHPLC法，该方法操作简便、专属性强，可用于VPA血药浓度检测和药动学研究。

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Simultaneous Determination of Sodium Valproate and Its Metabolite in Human Plasma by RP-HPLC

ZHANG Lingmin1，XIE Juan2，LI Longkuan3，LIAO Ronghua1，QIU Zhongyan4（1.Basic Medical College，Guizhou Medical University，Guiyang 555004，China；2.Dept.of Pharmacy，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang 550002，China；3.Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 558000，China；4.Dept.of Pediatrics，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang 550002，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of sodium valproate（VPA）and its metabolite 2-propyl-2-pentenoic acid（2-ene-VPA）in human plasma.METHODS：Plasma sample was extracted with cyclohexane and experienced derivatization with 2，4′-dibromoacetophenone using n-octanoic acid as an internal standard.RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（65∶35，V/V）at the flow rate of 1 mL/min.The column temperature was set at 35②，and UV dectection wavelenth was set at 258 nm. The sample size was 20 μL.RESULTS：The linear range of VPA and 2-ene-VPA were 5.0-200.0，0.5-20.0 μg/mL（r＝0.999 9，n＝5）.The limits of quantification were 5.0，0.5 μg/mL.RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 5%.Method recoveries were 95.99%-98.80%and 97.40%-98.17%，and extraction recoveries were 80.46%-86.23%and 80.45%-85.61%.The plasma concentrations of VPA in 10 epileptic children were 27.4-93.2 μg/mL，and those of 2-ene-VPA were 0.85-3.94 μg/mL，respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，specific and suitable for plasma concentration determination and pharmacokinetic study of VPA.

Sodium valproate；2-propyl-2-pentenoic acid；RP-HPLC；Derivatization；Plasma concentration

R969

A

1001-0408（2017）05-0611-04

2016-07-05 修回时间：2016-10-20）

（编辑：张元媛）

贵州省卫生计生委科学技术基金项目（No.gzwjkj2015-1-076）

＊硕士研究生。研究方向：临床药理学。电话：0851-85923180。E-mail：332300028@qq.com

#通信作者：主任药师，硕士生导师，博士。研究方向：临床药理学。电话：0851-85923180。E-mail：xiejuan945@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.05.09