纳米银对多菌种生物膜中粪肠球菌的杀菌作用

张富华 李矛 韦智君 张建凤

细菌感染是引起根尖周病的主要原因，根尖周炎的治疗效果取决于是否能够完全清除坏死的根管系统内感染的微生物[1]。而且，现今的研究发现牙髓根尖周病的细菌感染主要是以微生物生物膜形式存在[2]。致病的生物膜中通常是具有多种细菌微生物相互作用形成[3]。有消毒灭菌效果的根管冲洗液和其他局部试剂及药物对清除这些微生物具有十分重要的作用[4]。纳米银作为无机抗菌材料，由于其原子排列表现为介于固体和分子之间的“介态”表现出量子效应、小尺寸效应和极大的比表面积，具有其他载银无机抗菌材料无法比拟的抗菌活性[5]。本研究在MBECTMP&G Assay上构建多菌种生物膜，检测纳米银颗粒对于多菌种生物膜内粪肠球菌杀菌效果，为无机纳米抗菌剂应用于根管消毒提供实验依据。

1 材料与方法

标准菌株粪肠球菌(Enterococcusfaecalis，ATCC 29212)，具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，ATCC 25586)，产黑色素普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica，ATCC 25845,安徽医科大学微生物学中心实验室提供)。

1.1 细菌复苏培养鉴定和菌悬液制备粪肠球菌

首先将粪肠球菌和产黑色素普雷沃菌接种到牛心脑浸液(BHI)琼脂平板，具核梭杆菌转种至含 5%(W/V)脱纤维羊血的厌氧琼脂平板上。3 种细菌置厌氧环境中(80%N2， 10%H2，10%CO2)， 37 ℃培养备用。以McFarland标准用细菌浊度仪调菌悬液浓度至107～108CFU/ml备用。将混合菌悬浊液放入MBECTMP&G Assay装置，分成3 个实验组(每组25 个样本)和1 个阴性对照组(10 个样本)。3 个实验组中分别加入：0.1%纳米银颗粒(12～15 nm)悬浊液，0.1%纳米银颗粒(100 nm)悬浊液和2%次氯酸钠溶液各100 μl。阴性对照组加入100 μl生理盐水(PS)。

利用粪肠球菌选择琼脂，KVLB冻溶血平板和具核梭杆菌选择培养基[6]分别用来分离培养，以确定生物膜内各种细菌的存在。

1.2 叠氮溴化丙锭(PMA)处理

按照李聪聪等[7]的方法制备叠氮溴化丙锭(PMA)储备液并进行PMA处理。

1.3 DNA提取以及荧光定量PCR(qPCR)检测

将所有样本利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(ATP Genomic DNA Mini Kit®; ATP Biotech, Taipei,Taiwan)提取基因组DNA，作为荧光定量PCR的反应模板。操作按照生产厂家说明书进行。采用Taqman®qPCR 方法定量检测粪肠球菌[8]。

每次定量 PCR 反应都设空白对照(以相同体积的双蒸水取代 DNA)，每次测定设2 个平行样。

1.4 qPCR标准曲线的建立

将提取到的 DNA 标准品采用去离子水10 倍梯度稀释，进行PCR反应，以标准品浓度的对数值为横坐标，以临界循环数(cycle threshold, Ct)数值为纵坐标

建立qPCR 的标准曲线(图 1)。

图 1 qPCR结果的标准曲线

1.5 统计分析

使用SPSS软件利用配对t检验方法和独立样本t检验方法对实验数据进行统计分析。

2 结 果

将3 个实验组和阴性对照组中分别使用PMA和未用PMA处理粪肠球菌得到的qPCR的Ct值进行配对t检验(表 1)。

将3 个实验组和阴性对照组使用和不使用PMA qPCR检测到的Ct值的差值(利用独立样本t检验进行比较：纳米银(12～15) nm实验组的差值要大于纳米银(100 nm)实验组，结果具有统计学差异(P<0.05)；纳米银(12～15) nm实验组的差值要大于次氯酸钠实验组，结果具有统计学差异(P<0.05)；纳米银(100 nm)实验组的差值要大于次氯酸钠实验组，结果具有统计学差异(P<0.05)(表 2)。

表 1 各组使用PMA和未用PMA粪肠球菌qPCR的Ct值变化

表 2 粪肠球菌qPCR的Ct值变化(△Ct)组间两两比较

3 讨 论

目前研究发现纳米银对于浮游状态的粪肠球菌[9]以及生物膜状态的粪肠球菌[10-11]都有着抑制作用。但是，研究中的生物膜均为单一菌种生物膜，本研究中选取3 种细菌构建混合菌种生物膜，以生存在混合菌种生物膜内的粪肠球菌为抗菌研究对象更加符合临床感染根管内细菌感染情况。

本实验选取3 种细菌(粪肠球菌，产黑色素普雷沃菌以及具核梭杆菌)构成多菌种生物膜，并分析抗菌药物对于其中粪肠球菌的抗菌作用，原因在于: ①这3 种细菌都可以在根管治疗失败的感染根管中分离出[12-14]；②顽固性性根尖周炎及治疗后再感染的根管内粪肠球菌是主要的致病菌[14-16]；③这3 种细菌可以形成生物膜并且可以共聚集在一起。

检测存在于感染性疾病病灶中的生活致病菌对于疾病的诊断和治疗有着重要意义。近年来学者们利用DNA结合染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide，EMA)和PMA;PMA用来判别和检测死亡细菌和生活细菌。PMA和EMA可以选择性的结合死亡细胞(细胞壁和细胞膜已破损的细胞)“暴露”出来的DNA，然后与定量PCR联合使用，不扩增死细胞的DNA，选择性的扩增活细胞DNA，从而可以定量检测生活细菌[17-22]。但是，一些研究发现EMA可以穿透某些细菌的生活细胞细胞膜[20,23-24]，从而可能会影响实验的准确性。 因此，本研究采用PMA结合定量PCR方法检测多菌种生物膜内生活粪肠球菌的数量及其活菌数量，以此来分析抗菌药物的杀菌作用。

本研究发现各试验组中使用PMA和不使用PMA的Ct值的差别都具有统计学意义(P<0.05)。说明不同直径(12～15 nm，100 nm)的纳米银颗粒和次氯酸钠溶液对于多菌种生物膜中的粪肠球菌都有着显著的抑制作用。本研究将qPCR检测到的Ct值的差值利用独立样本t检验以比较不同抗菌剂的抗菌性能的差异，结果发现不同直径的0.1%纳米银颗粒的Ct值要高于2%次氯酸钠，差异具有统计学意义(P<0.05)；直径12～15 nm纳米银颗粒的Ct值要高于100 nm的纳米银颗粒，差异具有统计学意义(P<0.05)。纳米银的抗菌机制可能是因为其颗粒粒径小，容易穿透细菌胞膜进入菌体内，具有量子尺寸效应和表面效应，和致病微生物的蛋白质、核酸结合作用有关[25-26]，而纳米银颗粒的直径越小，表面效应越强，和微生物作用位点结合作用越强[26-27]。