知柏地黄丸对阴虚“上火”证血清抗炎凝血蛋白的影响

毛连根 刘昌铭 杨 粟 江婷婷 陈钟梁 屠慧惠 陈 静 胡玉婷 甘 霖 李仲杰 李继承，

(1 浙江大学细胞生物学研究所，杭州，310058； 2 华南理工大学医学院，广州，510006)

知柏地黄丸对阴虚“上火”证血清抗炎凝血蛋白的影响

毛连根1刘昌铭1杨 粟1江婷婷2陈钟梁1屠慧惠1陈 静1胡玉婷2甘 霖2李仲杰1李继承1，2

(1 浙江大学细胞生物学研究所，杭州，310058； 2 华南理工大学医学院，广州，510006)

目的：探究知柏地黄丸(Zhibai Dihuang Granule；ZDG)对阴虚“上火”证血清抗炎凝血蛋白的影响。方法：通过腹腔注射三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine；T3)处理SD大鼠建立阴虚模型。在该模型基础上往大鼠牙龈出滴加牙龈卟啉单胞菌叠加口腔牙龈炎模型，建立阴虚“上火”证大鼠模型。用滋阴降火药知柏地黄丸对大鼠进行治疗，以iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白组学技术与生物信息学手段分析治疗前后阴虚“上火”大鼠血清差异性蛋白表达谱，探索知柏地黄丸治疗阴虚“上火”的生物学机制。结果：知柏地黄丸观察组大鼠血清凝溶胶蛋白(Gsn)、纤溶酶原(Plg)、纤维蛋白原α链(Fga)、胸腺素β4(Tmsb4x)比值显著上调(Fold Change>1.25)；胶原蛋白α2-I型链(Col1a2)比值显著下调(Fold Change<0.8)。Gsn是机动蛋白丝的切割蛋白，参与细胞凋亡、清除损伤组织、调节炎性介质等生物学功能；Plg是血液纤维蛋白水解酶无活性的前体，参与机体纤溶、细胞迁移、细胞外基质降解等多种生物过程；Fga是由肝脏合成的纤维蛋白前体，能在内源凝血因子或外源组织因子作用下生成纤维蛋白，参与机体的凝血过程；Colla2是由肝、巨核细胞合成的凝血蛋白酶，是活化Fga的凝血稳定因子，Fga在Colla2的作用下参与完成凝血过程；T-β4是由胸腺产生的淋巴生长因子，具有通过抑制巨噬细胞的迁移、增强抗原提呈细胞功能、抑制炎性因子、促进组织重塑、血管生成和伤口愈合修复等生物学功能。结论：知柏地黄丸通过对Gsn、Plg、Fga、Colla2、T-β4水平的调节，清除损伤组织，释放肌动蛋白、细菌脂多糖，抑制细胞凋亡作用；并且可以调节炎性因子，改变炎性反应部位血液流变动力学障碍，促进炎性反应损伤的愈合的作用。

知柏地黄丸；阴虚“上火”；蛋白组学；抗炎；凝血；发病机制

中医认为情志是机体的精神状态，是人对客观外界事物和现象所做出的7种不同情绪反映[1]。情志与脏腑的功能活动密切相关，情志过激可致相火妄动，相火妄动是导致疾病的因素之一[2-3]。以腹腔注射三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine；T3)处理SD大鼠建立阴虚模型[4]，并在模型基础上叠加口腔牙龈炎模型，建立阴虚“上火”证(Yin-deficiency-Shanghuo Syndrome，YDS)大鼠模型；以iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白组筛选鉴定技术与生物学信息手段探究知柏地黄丸对YDS大鼠血清抗炎凝血生物物质的变化，为探究阐明知柏地黄丸滋阴降火治疗机制与阴虚“上火”证病机提供现代生物学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取SPF级雌性SD大鼠30只(浙江省医科院实验动物中心提供，生产许可批准文号：SCXK(浙)2014-0001)。

1.1.2 药物 三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine；T3，北京百灵威科技有限公司，生产批号：L840O63)；牙髓卟啉单胞菌冷冻干菌粉(广东省微生物菌种保藏中心，生产批号：201505)；戊巴比妥钠(中国医药上海化学试剂公司(进口分装)，生产批号：020402)；知柏地黄丸(ZhibaiDihuangGranule；ZDG，仲景宛西制药股份有限公司，生产批号：161204)。

1.1.3 试剂与仪器 iTRAQ试剂盒(Applied Biosystems，Foster city，CA,USA)；LCMS-8030、Triple Quadrupole MS/MS(日本岛津制作所)；超低温冰箱THERMO(902-ULTS)；离心机(SIGMA,2K15C)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 取5～6周龄，体重220～240 g SPF级雌性SD大鼠30只。称重，随机分成YDH模型组(简称：模型组)、生理盐水对照组(简称：对照组)、知柏地黄丸观察组(简称：观察组)3组，每组10只。第2天开始，模型组、观察组每天下午4点腹腔注射T3(2.5 mg%，0.2 mL/100(g·d))、对照组腹腔注射0.9%生理盐水(0.2 mL/100(g·d))，连续造模6 d。此间，模型组、观察组大鼠，于腹腔注射T3第4天以2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉，用丝线结扎下门齿，剥离部分牙龈，滴注PBS(pH7.2)稀释至近似3×108/mL的牙髓卟啉单胞菌液，200 μL/(次·d)，共4次进行牙龈炎造模。对照组大鼠不进行牙龈炎造模。第7天起，观察组灌胃知柏地黄丸中药(0.8 g/1 mL，1 mL/100(g·d)、模型组与对照组灌胃(0.9%生理盐水，1 mL/100(g·d)。连续给药治疗7 d。给药治疗第8天，观察组于给药后2 h(对照组、模型组于给生理盐水后2 h)以2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉，进行颈中动脉插管手术取血采样。将血分别置于无肝素试管，室温静置2 h，3 000 r/min，离心10 min，提取血清，置-80 ℃备用。

1.2.2 iTRAQ-2DLC-MS/MS血清差异蛋白筛选鉴定分析 血清高丰度蛋白去除：用4.6×100 mm多亲和处理系统(MARS)LC Column-Human 14结合HPLC系统处理血清样品，除去14种高丰度蛋白(血清白蛋白、免疫球蛋白G，抗胰蛋白酶，IgA，IgM等)。iTRAQ试剂标记：每组取等量血清样本，先用预冷的丙酮处理，12 000 r/min离心15 min后弃去上清后，用试剂盒中自带的溶解液和1% SDS充分混悬溶解样品；还原试剂于60 ℃反应1 h；半胱氨酸封闭试剂于室温处理10 min；胰蛋白酶于37 ℃酶解过夜，使蛋白质酶解。在118、119、121各管标记试剂中加入50 μL异丙醇，混匀，分别加入各组样品中于室温反应1 h，各加入3倍体积水，使标记试剂分解。最后合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥处理。第一维SCX分离肽段：将iTRAQ试剂标记的样品混合物加入强阳离子交换(SCX)柱中多次洗脱。根据峰型和时间共收取10个梯度，真空离心浓缩后，用反相液相色谱的A相溶解。第二维反相液相色谱：用ZORBAX 300SB-C18column处理，用不同浓度的乙腈和甲酸的洗脱液洗脱。LC-MS/MS分析：将2DLC分离获得的蛋白质直接进行后续质谱扫描分析。在QSTAR XL在IDA模式下操作，在m/z 400-1 500范围内进行MS分析，在一个图谱选择20个最强的母离子进行串级扫描，扫描范围m/z 100-2 000。获得差异蛋白表达谱。

1.2.3 生物信息学分析 采用Protein Pilot 4.2 beta软件分析数据，检索International Protein Index(IPI)数据库，并对其定量。使用DAV ID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)方法对蛋白质注释和分类。蛋白之间的互作关系应用STRING软件完成(http://string.embl.de/)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，采用t检验分析，非参数分析用Mann-Whitney U-test检测，组间差异比较采用单因素方差分析。差异蛋白比倍率>1.25或<0.8认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 知柏地黄丸治疗阴虚大鼠“上火”血清差异性蛋白筛选鉴定分析结果 观察组血清凝溶胶蛋白(Gsn)、纤溶酶原(Plg)、纤维蛋白原α链(Fga)、胸腺素β4(Tmsb4x)比值显著上调(Fold change>1.25)；胶原蛋白α2-I型链(Col1a2)比值显著下调(Fold change<0.8)。见表1。

注：差异蛋白比倍率>1.25或<0.8认为差异有统计学意义

3 讨论

阴虚“上火”是现代社会多发频发病证，诱因复杂。现代医学对阴虚“上火”缺乏有效的治疗方法，但中医对阴虚“上火”的认识已历史悠久，《黄帝内经·素问》[5]，《景岳全书》[6]等许多中医经典对“上火”证病机与治疗早有详细记载。阴虚“上火”系人体阴阳失衡内热亢盛，“相火妄动”所致，对于该证以滋阴降火为治疗原则。阴虚“上火”证主要表证为反复发作的口腔溃疡、牙龈肿痛炎、鼻扭、慢性咽喉炎等与皮肤黏膜关联密切的炎性反应，而炎性反应是机体血管生物物质对于机体损伤的防御反应，炎性反应发生进程中的血管中的抗炎与凝血生物物质对于防御反应具有重要作用。以知柏地黄丸为工具探究阴虚“上火”证血管中的抗炎与凝血生物物质的变化，对于阐明知柏地黄丸滋阴降火作用机制及阴虚“上火”证病机具有重要意义。

研究结果显示，知柏地黄丸具有上调血清Gsn、Plg、Fga表达的作用。Plg是机动蛋白丝的切割蛋白，在CaCl2、pH、磷酸磷脂酰肌醇等作用下，能参与对肌动蛋白丝的剪切、聚合和解聚；也可以作为细胞凋亡过程中关键的执行分子之一胱天蛋白酶的底物与二磷酸磷脂酰肌醇-3形成的复合体，降低二磷酸磷脂酰肌醇-3活性，进而抑制细胞凋亡过程[7]；Gsn还能与脂多糖结合蛋白(LBP)竞争性结合脂多糖，抑制与肌动蛋白的结合活性和血清肌动蛋白的解聚活性；Gsn能在清除损伤组织细胞释放的肌动蛋白同时，对炎性反应递质进行调节[8-9]。血液中Gsn过表达有利于减轻炎性反应与炎性反应损伤的愈合[10]。知柏地黄丸对Gsn的上调作用提示知柏地黄丸具有清除损伤组织细胞释放的肌动蛋白、降解脂多糖，减轻炎性反应促进炎性反应损伤愈合和抑制细胞凋亡的作用。

研究结果显示，知柏地黄丸组还具有上调Plg、Fga下调Colla2的作用。Plg是血液纤维蛋白水解酶无活性的前体，其能在内源性纤溶酶原激活物或外源激活物的作用下活化成纤溶酶，参与机体纤溶、细胞迁移、细胞外基质降解等多种生物过程。知柏地黄丸上调Plg表达，提示知柏地黄丸具有提高纤溶酶生成基质，促进纤溶酶生成量进而改变炎性反应损伤组织部位血液流变动力学障碍，促进炎性反应伤口愈合作用。Fga是由肝脏合成的纤维蛋白前体，能在内源凝血因子或外源组织因子作用下生成纤维蛋白，参与机体的凝血过程。Colla2是由肝、巨核细胞合成的凝血蛋白酶，是活化Fga的凝血稳定因子，Fga在Colla2的作用下参与完成凝血过程。知柏地黄丸上调血清Fga表达，但对Colla2显著下调，这样仍然影响凝血形成过程。这提示知柏地黄丸具有抗凝血形成的促进血液循环作用。

研究结果还显示，知柏地黄丸具有上调T-β4表达作用。T-β4是由胸腺产生的淋巴生长因子，其具有通过抑制巨噬细胞的迁移，增强抗原提呈细胞功能，抑制炎性因子，降低炎性反应细胞的浸润，减轻炎性反应与防止新生组织受到炎性反应的损害的作用[11]；T-β4还具有促进组织重塑、血管生成和伤口愈合修复等功能[12]。知柏地黄丸上调T-β4表达的作用，这表明知柏地黄丸具抑制炎性因子，增强抗炎与炎性反应伤口愈合修复能力的作用。

上述结果提示：知柏地黄丸通过对Gsn、Plg、Fga、Colla2、T-β4蛋白组的调节改变阴虚“上火”证炎性反应损伤组织部位的血液流变动力学障碍，促进血液循环及抑制细胞凋亡，增强抗炎与炎性反应伤口愈合修复能力。这结果也提示阴虚“上火”证炎性反应反复发作与这些蛋白的调节改变密切关联。

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EffectofZhibaiDihuangGranuleonAnti-inflammatoryandClottingSerumProteinsinYin-deficiencyShanghuoSyndrome

Mao Liangen1, Liu Changming1, Yang Su1, Jiang Tingting2, Chen Zhongliang1, Tu Huihui1, Chen Jing1, Hu Yuting2, Gan Lin2, Li Zhongjie1, Li Jicheng1, 2

(1InstituteofCellBiology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2SchoolofMedicine,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Objective:To explore the influence of Zhibai Dihuang Granule (ZDG) on the anti-inflammatory clotting serum proteins in Yin-deficiency Shanghuo(YDS) syndrome. Yin-deficiency SD rats were induced by intraperitoneal injection of Triiodothyronine (T3). The models of gingivitis in rats were induced by dropwise add of porphyromonas gingivalis model. YDS syndrome rats were treated with ZDG for 1 week. iTRAQ-2DLC-MS/MS was used in screening and identifying the serum differential proteins. With the treatment of ZDG, the serum level of Gelsolin (Gsn), Plasminogen (Plg), Fibnnogenalpha chain (Fga), and Thymus beta-4 (T-β4) were significantly increased (fold change>1.25), while the serum level of Collagulation factor XIII Achain and Colla2 were significantly decreased (fold change<0.8). Gsn possesses the function of removing damaged tissue, releasing the actin, inhibiting the apoptosis of the cells, and inhibiting the apoptosis of the cells. Colla2 and Plgcan regulated the change of blood rheology in the inflammatory site. Gsn and T-beta 4 presented the ability in regulating inflammatory cytokines to promote the healing of inflammatory damage.ConclusionZDG may play an important role in clearing actin and lipopolysaccharide released by damage tissue and inhibiting the cell apoptosis. Besides, ZDG may regulate inflammatory factors, change the blood rheology of the inflammatory site, promot the healing of inflammatory damage. In short, ZDG treats YDH syndrome by regulating these proteins associated with anti-inflammatory and clotting.

Zhibai Dihuang Granule; Yin-deficiency Shanghuo syndrome; Proteomics; Anti-inflammatory; Clotting; Pathogenesis

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.006

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2014CB543002)

毛连根(1957.06—)，男，硕士，实验师，研究方向：药理学，E-mail：zdmlg301@126.com

李继承(1957.12—)，男，硕士，教授，浙江大学细胞生物学研究所所长，研究方向：肺结核生物学标志物及其中医证候的生物学研究，E-mail：lijichen@zju.edu.cn

(2017-11-03收稿 责任编辑：张文婷)