SCN1A基因变化在家族性热性惊厥发病中的作用

郭嘉诚赵 武

1.蚌埠市第三人民医院儿科（安徽蚌埠 233000）；2.蚌埠医学院第一附属医院儿内科（安徽蚌埠 233000）

SCN1A基因变化在家族性热性惊厥发病中的作用

郭嘉诚1赵 武2

1.蚌埠市第三人民医院儿科（安徽蚌埠 233000）；2.蚌埠医学院第一附属医院儿内科（安徽蚌埠 233000）

目的探讨SCN1A基因变化在家族性热性惊厥发病中的作用。方法收集8个家族性热性惊厥家系的临床资料，留取先证者和部分家系成员的血液标本，PCR扩增所有先证者SCN1A基因编码的26个外显子及其上下游侧翼序列至少50个以上碱基，并测序。对新发现的碱基变化，再对家系其他成员进行相应外显子的基因序列筛查，从而明确变异起源。同时纳入200例同年龄正常对照者加以验证。结果8例先证者存在33种碱基变化，其中32种被提交为单核苷酸多态性，一处为新发现的错义突变。家系4先证者第15外显子存在一错义突变（C.2650G＞A），该碱基变化尚未见报告，且证实突变遗传自先证者父亲。200名正常对照者相应外显子测序未发现该碱基变化。C.2650G＞A导致SCN1A第884位的甘氨酸为丝氨酸所替代（Gly884Ser）。突变位于电压门控钠离子通道α亚基第2同源结构域的第4次跨膜和第5次跨膜之间（DIIS4-S5），通过蛋白序列比对，该氨基酸高度保守。结论SCN1A基因突变与家族性热性惊厥的发病有关，电压门控钠离子通道α亚基电压感受器（S4）及离子通道孔（S5-S6）外区突变可能是引起表型相对较轻的癫痫综合征的重要原因。

热性惊厥； SCN1A基因； 家系； 遗传

热性惊厥（febrile seizures，FS）是儿童时期最常见的惊厥性疾病[1]。FS可散发，也可呈家族聚集性发病。家系分析显示FS具有遗传异质性，遗传方式复杂，常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和多基因遗传均有报道[2]。SCN1A为最重要的癫痫致病基因[3]，然而有学者对SCN1A基因突变与家族性FS的相关性持有争议[4，5]，国内迄今尚未见家族性FS SCN1A基因突变筛查的报道。本研究对新发现的8个家族性FS家系进行遗传学监测，对其最重要的癫痫致病基因（SCN1A基因）进行筛查，寻找基因突变，并分析突变特点，探讨SCN1A基因变化在家族性FS发生中的作用。

1 临床资料

8个家系的先证者（F1-F8）均因FS分别于2013年1月至2013年12月就诊于蚌埠市第三人民医院。根据国际抗癫痫联盟（ILAE）1993年关于FS的定义，FS的临床诊断标准：发生于1月龄以后的一种癫痫样发作，通常与热性疾病有关，无中枢神经系统感染的证据，既往无新生儿癫痫或自发性癫痫病史，也不符合有诱发因素的急性症状性癫痫的诊断标准[6]。8个家系患儿均无脑炎、脑膜炎及头部手术、外伤史，首次发作均在1岁以后，无智力发育延迟，既往也无热惊厥发作史，均有明确的热性惊厥家族史。纳入200例同期来院就诊的出生地域与病例组相同且无惊厥史的汉族儿童作为正常对照。其中男112例、女88例，年龄1～4岁。试验方案获得医院医学伦理委员会批准，所有先证者父母均被告知试验目的和研究意义，并签署知情同意书。

通过家系调查获得8例先证者详细发病信息，建立家系图谱（图1）。8个家族性热性惊厥家系，先证者男7例、女1例，中位年龄2.5岁（1～4岁）。8个家系共20例受累者，男12例、女8例，所有受累者惊厥发作均在1岁以后，发作类型几乎均为全面性强直-阵挛性发作（GTCS）；家系中部分成员接受了脑电图、头颅CT或脑脊液检查，未发现异常；20例受累成员未见无热惊厥和部分性发作，无智力损害和发育迟缓；多数家系呈常染色体显性遗传，且经2、3代遗传，其中家系6先证者（III-1）为热性惊厥患者，其父母并无热性惊厥发作史，但姑姑（II-3）幼时有热性惊厥发作史，且5岁以后未见复发，为常染色体隐性遗传。家系中受累者的主要临床资料见表1。

图1 8个家族性热性惊厥家系图谱

表1 家系受累成员临床资料汇总

采集FS先证者静脉血2 mL用于SCN1A基因PCR扩增和产物测序分析，采用天根生化科技（北京）有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取全血基因组DNA，所提基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度（OD值）和浓度。①引物设计，首先从网上获得SCN1A基因组全序列（NC_000002.12），用在线Primer3引物设计软件设计引物，并经GenBank BLAST验证引物特异性。PCR引物设计目标：扩增SCN1A基因编码的26个外显子及其上下游侧翼序列至少50个以上碱基。引物序列和扩增片段大小见表2。②PCR检测，采用降落PCR（touchdown PCR，TD-PCR）扩增外显子1～26。反应条件：95℃预变性15 min，94℃变性15 s，62℃退火40 s，72℃延伸l min，以后每个循环退火温度依次降低0.5℃，直到57℃，共11个循环。此后，94℃变性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸l min，共24个循环。72℃总延伸2 min，反应终止后置4℃保存。PCR产物均进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。③产物测序，选取条带清晰无杂带的PCR产物10 μL送上海天昊生物科技有限公司进行纯化和测序。④测序结果分析，应用Chromas223软件，正常序列为GenBank人SCN1A全基因组DNA序列（NC_000002.12），编码区序列（CDS_AB093548），蛋白质序列（BAC21101），如发现SCN1A基因碱基变化，对患儿父母及200例正常对照者进行相应片段的PCR扩增和测序，以排除单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）并确定突变来源，必要时以反向引物进行测序验证。

表2 SCN1A基因PCR引物序列及扩增片段长度

8例先证者SCN1A基因测序筛查发现存在33种碱基变化，通过检索PubMed SNP数据库及人类基因突变数据库，其中32种被提交SNP，1种为新发现的错义突变位点，该碱基变化尚未见报告，未发现已被报道过的突变位点存在突变，先证者F4第15外显子上存在一错义突变c.2650G＞A（图2），导致SCN1A基因编码的氨基酸第884位甘氨酸为丝氨酸所取代（Gly884Ser），所有正常对照者均未发现相同位点的碱基变化，先证者F4为独子，其所在家系共3例受累者，III1（F4）、II2、II4，对家系其他成员相应外显子进行筛查，该突变遗传自父亲（II2）。经过蛋白比对，SCN1A第884位的甘氨酸不仅在人、小鼠、大鼠、斑马鱼、黑猩猩等物种间高度保守（图3），而且在电压门控钠离子通道α亚基单基因家族成员中也是高度保守的（图4）。经网上核实（http://www.uniprot.org/ uniprot/），Gly884Ser位于电压门控钠离子通道第II同源结构域的第4次跨膜和第5次跨膜之间（DIIS4-S5）

图2 先证者F4（A）SCN1A基因第15外显子c.2650G＞A突变及正常对照（B），箭头所指为突变位点

图3 不同物种之间SCN1A蛋白质序列比对，884位甘氨酸高度保守

图4 人电压门控Na+通道单基因家族成员编码蛋白序列比对，884为甘氨酸高度保守高度保守

2 讨论

FS具有遗传异质性。一级亲属FS阳性家族史是FS最常见的危险因素，且随有FS病史的一级亲属人数的增多危险性增加，约25%～40%的FS患儿有阳性家族史，FS患儿的同胞发生FS的危险为9%～22%，单卵双胎儿较异卵双胎儿易于发生FS[1]。父母双方有FS病史者其子代发生FS的危险较父母单方有FS病史者增加2倍[7]。通过检索在线人类孟德尔遗传数据库（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），自1996年以来已有12个家族性FS易感基因座或致病基因被定位或确定，并被OMIM依次被命名为FEB1-FEB11，其中SCN1A被认为是最重要的癫痫致病基因[3]。然而由于FS具有高度的遗传异质性，迄今尚未证实FS特异性的遗传基因座始终参与FS的发病[8]。

本研究多数家系呈常染色体显性遗传，且经2、3代遗传，其中家系 6为常染色体隐性遗传，经SCN1A基因筛查，未发现该家系存在基因突变，仅在家系 4第15外显子发现一错义突变c.2650G＞A，证实了FS的遗传异质性。分析原因，一方面可能还有其他致病基因或环境因素参与FS的发病；另一方面，文献报道，SCN1A基因SNP可能会增加FS的发病风险，如本研究发现的rs3812718（SCN1A IVS5N+5G＞A）。大样本对照研究显示，rs3812718与癫痫的发病存在强烈的关联，等位基因G与A比值比（OR）=0.85，P= 0.0009，基因型GG与基因型AA的OR=0.73，P= 0.003[9]。OR在不同种族间从0.76到0.87。这种关联在印第安人群和热性惊厥患者中尤为明显。等位基因G可影响SCN1A基因的拼接和电压门控钠离子通道从失活状态恢复的速度，由于SCN1A优先在中枢抑制性神经元表达，作者认为等位基因G可能降低癫痫的发病风险。

SCN1A基因编码电压门控钠离子通道，在控制动物细胞电兴奋性中发挥关键作用，它由1个高度保守的α亚基和2个辅助的β亚基（β1，β2）组成，α亚基是钠通道的主要功能区域，该亚基由4个同源结构域（DI-DIV）组成。每一个同源结构域含有6个跨膜片段，分别命名为S1-S6，其中S4为电压感受器，其氨基酸残基富含正电荷，在序列上最为保守，在调控通道正常功能中起重要作用，S5和S6构成部分离子通道孔，是离子通道最为重要的组成部分[10]。人电压门控Na+通道是一个单基因家族，有不同的亚型，包括 Nav1.1-Nav1.9，分别由 SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A基因编码，其中只有SCN1A、SCN2A、SCN3A和SCN8A在中枢神经系统表达[11]，2000年 Escayg等[12]首次报道在全面性癫痫伴热性惊厥附加征（GEFS+）家系中发现SCN1A基因突变，随后的10余年间，已有700余例SCN1A突变相继报道[13]。国内学者对SCN1A基因的研究也越来越多，新的突变位点也不断被发现，如c.2592G＞A，c.1212G＞A[14]等，其所致疾病谱从表型较轻的GEFS+[12]、部分性癫痫伴热性惊厥附加征（PEFS+）[15]，到严重的婴儿重症肌阵挛性癫痫（SMEI）[16]均有发现，这种表型的多样性、复杂性与SCN1A 突变的位置、类型及功能学改变有关。

遗传学研究表明，表型较重的SMEI以SCN1A错义突变和蛋白截短突变为主，且大多位于电压感受区（S4）和孔区（S5-S6）；而症状相对较轻的GEFS+、PEFS+则以孔区外的错义突变为主[17]。本研究在家系4发现的Gly884Ser位于电压门控钠离子通道α亚基第II个同源结构域的第4次跨膜和第5次跨膜之间（DIIS4-S5），此位点避开了钠离子通道重要的电压感受器区（S4）和通道孔的形成区（S5-S6），该家系患者所呈现的临床症状与鉴定出的SCN1A突变特点相吻合，表型较轻，仅表现为简单的热性惊厥发作。

SCN1A 基因不同位点、不同类型的突变对钠通道功能的影响不同，可以引起钠通道功能增加或缺失，使离子通道的兴奋性增加或降低，从而导致不同的癫痫表型，Mantegazza等[4]对一个有12例简单型FS患者的意大利4代家系进行连锁分析，发现SCN1A基因α亚单位同源结构域I第1个跨膜片段（D1S1）存在一杂合错义突变（p.M145T），第145位的蛋氨酸被苏氨酸替换，哺乳动物细胞功能研究证实p.M145T是一个功能缺失突变体，从而证实SCN1A基因功能缺失突变与家族性简单型FS有关。Lossin等[18]在对GEFS+家系的3个突变体体外电生理研究时发现，3个突变体（T875M,W1204R, R1648H.）都能改变钠离子通道的灭活过程，导致持久性的钠离子内流增加，这种功能性增加突变体通过引起细胞膜的持久性去极化进而增强神经细胞膜的兴奋性，从而导致癫痫发作。即使是同一位点的突变，其氨基酸残基置换的不同亦可导致不同的电生理学改变，引起不同的癫痫类型，如均是1648位精氨酸残基发生突变，R1648C比R1648H有更明显的持续电流，从而导致前者出现SMEI症状，而后者则表现为PEFS+[19]。本研究经过蛋白序列比对，SCN1A基因第884位的甘氨酸在进化上高度保守，提示在电压门控钠离子通道的生理功能中可能发挥重要作用，甘氨酸为非极性疏水性氨基酸，丝氨酸为极性中性氨基酸，二者属于不同类的氨基酸，氨基酸的这种变化可能对蛋白质的结构和功能产生显著影响。故SCN1A的突变位点、类型对电压门控钠离子通道蛋白的结构、电生理学属性的影响及其与癫痫临床表型的相互关系有待进一步研究。

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Role of SCN1A gene variations in the development of familial febrile seizures

GUO Jiacheng1，ZHAO Wu2(1.Department of Pediatrics，The Third People's Hospital of Bengbu，Bengbu 233000，Anhui，China；2.Department of Pediatrics，The First Af fi liated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，Anhui，China)

ObjectiveTo determine the role of SCN1A gene variation in the development of familial febrile seizures（FS）.MethodsClinical data were collected from 8 familial FS pedigrees, and peripheral venous blood samples were collected from the probands and other available family members.All 26 coding exons and exon-intron boundaries at least 50 bases of the human SCN1A gene were ampli fi ed by polymerase chain reaction, the products were subsequently sequenced.To novo variation, other family members were screened for the corresponding exons.Two hundred age-matched healthy children were served as normal controls.ResultsA total of 33 variations in the SCN1A gene were identi fi ed in these families.Of these variations, one was a missense mutation; the remaining 32 variations were previously submitted as single nucleotide polymorphisms (SNPs).A c.2650G＞A heterozygous missense mutation in exon 15 of the SCN1A gene found in the proband of family 4 was inherited from his father who had seizures with fever in early childhood.The c.2650G＞A mutation was absent in the 400 alleles of normal controls.To the best of our knowledge, the SCN1A c.2650G＞A mutation has neither been reported in the NCBI SNP database nor in the literature to date.The c.2650G＞A mutation changes a glycine at amino acid 884 in the SCN1A protein to a serine (p.Gly884Ser).Protein sequence analysis showed that the p.Gly884Ser is located at a highly conserved region between the 4th and 5th transmembrane segment of the homologous domain II of voltage-gated sodium channel 1 subunit (DIIS4-S5).ConclusionsThe pathogenesis of familial febrile seizures was related to the SCN1A variation, the mutation outside the region of the voltage sensor (S4) and ion channel pore (S5-S6) of the voltage gated sodium channel α-subunit may be an important factor to cause mild phenotype epilepsy syndrome.

febrile seizures; SCN1A genes; family; heredity

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.014

2015-04-03)

(本文编辑：蔡虹蔚)

赵武 电子信箱：bbyxyzhaowu@126.com