加压毛细管电色谱分离检测虎杖根中蒽醌类成分

肖晓茹，冯 军，程 昊,2,3，黄文艺,2,3，李彦青,2,3，赵彦勇，李利军,2,3*

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西科技大学，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；3.广西科技大学，广西高校糖资源加工重点实验室，广西柳州 545006;4.广西科技大学 医学院 药学系，广西 柳州 545005)

加压毛细管电色谱分离检测虎杖根中蒽醌类成分

肖晓茹1，冯 军2,3,4，程 昊1,2,3，黄文艺1,2,3，李彦青1,2,3，赵彦勇1，李利军1,2,3*

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西科技大学，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；3.广西科技大学，广西高校糖资源加工重点实验室，广西柳州 545006;4.广西科技大学 医学院 药学系，广西 柳州 545005)

建立了加压毛细管电色谱法(pCEC)检测大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌类成分的方法，并对虎杖根中蒽醌类的成分进行分析。该方法采用EP-100-20/45-3-C18毛细管色谱柱(总长度45 cm，有效长度20 cm，直径为100 μm，ODS填料3 μm)进行分离，流动相为20 mmol/L NaH2PO4(pH 4.7)-乙腈(15∶85)，流动相的总流速为0.04 mL/min，分离电压为+5 kV，紫外检测波长为254 nm。结果表明，5种蒽醌类成分的检出限(S/N=3)为0.60～2.54 μg/mL，在3.57～162.68 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.998 2。将所建立的方法用于虎杖中蒽醌类成分的分析，取得良好的实验结果，在低、中、高3个加标浓度下的回收率为91.1%～101.2%，相对标准偏差(RSD)为0.03%～3.6%。关键词：加压毛细管电色谱；虎杖；蒽醌

图1 5种蒽醌类物质的结构式Fig.1 Molecular structures of five anthraquinones

虎杖为蓼科植物，其根茎和根可以作为中药[1]，已收录于中国药典[2]。它具有清热解毒、止痛止咳化痰等作用，对湿热黄疸、痈肿疮毒、趺打损伤、肺热咳嗽等症有良好的治疗效果。虎杖的产地分布很广，包括广东、浙江、江苏、安徽、江西、四川，朝鲜和日本也有[3]。蒽醌类化合物是虎杖根中主要的有效成分之一，其中大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚为其主要起作用的成分[4]，具有抗菌消炎、抗病毒、扩张血管及利尿等多种药理作用。由于这5种成分结构相似(结构式如图1)，因此对它们的分离分析具有较为重要的现实意义。

目前关于虎杖中蒽醌类成分的分离分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3,5-6]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)[7]。其中HPLC法消耗的有机溶剂较多且分离周期较长；HPLC-MS的仪器昂贵，检测成本高。加压毛细管电色谱法(pCEC)是21世纪初发展起来的一种微分离技术，拥有高效液相色谱与毛细管电泳的双重分离机理，兼具两者的优势，以电渗流和压力流作为双重驱动力，根据在流动相和固定相的分配系数不同以及电泳淌度的差异，样品被快速高效的分离，具有选择性好、柱效高、分辨率高、分离快速及试剂消耗量少等优点[8]。pCEC采用二元高压泵，不仅解决了毛细管电色谱柱易干、易产生气泡的问题[9]，提高了稳定性，而且可用泵压力来调控流动相的流速，缩短样品的出峰时间，并能够运行毛细管电色谱的梯度洗脱程序同时实现定量进样[10]。因此，其具有较好的应用价值和发展前景。目前，pCEC已广泛应用于环境分析，食品安全检测，药物分析等研究领域[11-14]。但采用pCEC同时分离测定虎杖中蒽醌类成分的研究尚未见报道。本文建立了pCEC检测大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌类成分的方法，并对虎杖根中蒽醌类成分进行了分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TriSepTM-2100加压毛细管电色谱(上海通微分析技术有限公司)；UV-2102PC 型紫外-可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；DL-60D型80W超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；80-2型台式电动离心机(常州国华电器有限公司)；SZ-93型自动双重水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；PHS-25CW型实验室pH计(上海般特仪器有限公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；0.2 μm尼龙66针式过滤器(天津市津腾实验设备有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(上海锦赋实验仪器设备有限公司)。

大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚标准品(纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技有限公司)；虎杖样品购于柳州市中医院；磷酸二氢钠、乙酸钠(分析纯，广东汕头市西陇化工厂)；乙醇(分析纯，成都市科农化工试剂厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，Merck公司)；实验用水为二次蒸馏水。所用的试剂和溶液在进入加压毛细管电色谱仪之前需用0.2 μm针式微孔滤膜过滤，超声除气。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚标准品各0.6，0.7，0.5，1.2，1.3 mg，置于具塞离心管中，用适量甲醇溶解，分别配制成300 μg/mL大黄酸，350 μg/mL芦荟大黄素，250 μg/mL大黄素，400 μg/mL大黄酚，325 μg/mL大黄素甲醚的标准储备液，置于4 ℃避光保存，备用。

分别精密吸取大黄素甲醚储备液500 μL，大黄素储备液200 μL，大黄酸储备液100 μL，大黄酚储备液100 μL，芦荟大黄素储备液100 μL于具塞的离心管中，加甲醇稀释至1 mL，用旋涡混合器振荡摇匀，作为100%混合标准溶液。

1.2.2 样品提取 将虎杖样品粉碎后研磨成粉，准确称取虎杖样品粉末1.00 g(精确至0.001 g)，置于25 mL棕色容量瓶中。用甲醇溶解并定容至刻度，称取定容后的重量，用超声辅助提取30 min，待冷却后，再次称重，用甲醇补足丢失的重量。重复上述提取操作2次，静置24 h后，取上清液用0.2 μm的针式微孔滤膜过滤，滤液低温避光下保存待用。

1.2.3 pCEC-UV色谱条件 色谱柱为毛细管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，内径100 μm，总长度45 μm，有效长度20 cm，ODS填料内径3 μm)；流动相：乙腈-20 mmol/L NaH2PO4缓冲盐(pH 4.7)=85∶15；流动相的总流速为0.04 mL/min；分离电压+5 kV；检测波长为254 nm。进样量1 μL(分流比1∶24)，分流阀压力调节在6.0 MPa；电压施加在毛细管的出口端，进口端接地。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

用紫外分光光度计对大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚在200～800 nm波长之间进行扫描，5种物质在254 nm处均有紫外吸收且吸收较强，因此仪器的检测波长设置为254 nm。

2.2 有机流动相的优化

实验对有机流动相的种类和体积分数进行了优化。分别考察了甲醇和乙腈两种常用有机溶剂作为流动相的分离效果，结果表明，乙腈相比于甲醇，分析时间显著缩短，且获得的峰形尖锐，因此实验选择乙腈作为有机流动相。而乙腈在流动相中所占比例会影响样品在固定相和流动相之间的分配比例，进一步改变分离选择性。因此，本实验考察了乙腈体积分数分别为75%，80%，85%，90%时的分离效果。随着乙腈比例的逐渐上升，大黄酸的出峰时间变化较小，但芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的出峰时间明显缩短。75%和80%乙腈时，保留时间相对较长，峰拖尾严重；85%乙腈时，基线得到很好的分离，而且峰形好，理论塔板数高；而90%乙腈时，溶质的保留时间太短，导致芦荟大黄素和大黄素之间未能实现完全的基线分离。故实验选择85%乙腈为有机流动相。

2.3 缓冲盐的选择

在pCEC的分离系统中，在施加电压时为了能够形成稳定的电场和电渗流，需要在流动相中加入可以导电的酸碱或者缓冲盐溶液[11]。实验分别考察了常见缓冲盐乙酸铵和磷酸二氢钠对5种蒽醌类成分的分离影响，发现流动相中加乙酸铵缓冲盐时，溶质峰形不好，拖尾现象严重，而加入磷酸二氢钠可明显改善峰形，减轻或消除拖尾现象，提高灵敏度。进一步考察了5，10，20，25 mmol/L NaH2PO4缓冲盐的影响，结果显示，随着缓冲盐浓度的增大，流动相的离子强度变强，导电性增大，峰形得到明显改善，但当缓冲盐浓度过高时，电流值增大，产生较高的焦耳热，造成基线噪声较大，也易造成缓冲盐从流动相中析出，导致毛细管堵塞[10]。实验结果表明，缓冲盐的浓度为20 mmol/L时，5种成分的保留时间、峰形均较好，理论塔板数高。因此实验选择20 mmol/L NaH2PO4缓冲盐。

pH值的变化不仅会影响电渗流的大小，也会影响毛细管表面的电荷分布，从而影响分离度及分析速度[15]。本实验考察了不同pH值(4.7，5.7，6.7)对5种成分分离效果的影响。结果表明，pH值增大，大黄酸的出峰时间缩短，而芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的出峰时间延长。同时考虑到C18毛细管色谱柱的适用pH值范围在2.0～8.0之间，最终选择pH值为4.7。

图2 5种蒽醌类物质在不同电压条件下的色谱图Fig.2 Effect of applied voltage on pCEC separation of five anthraquinones 1.rhein；2.aloe-emodin；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion

2.4 分离电压的影响

电压主要影响电渗流大小和物质的保留时间。实验考察了不同分离电压(-8，-5，-2，0，+2，+5，+8 kV)对5种成分分离效果的影响。由图2可见，当在毛细管出口端施加负电压时，随着分离电压的不断增大，电渗流方向与压力流方向一致且呈增大趋势，整体的分析速度提高。施加正电压时，大黄酸的电泳反作用力与电渗流两者相互作用，而其他4种组分随正电压的增大，电渗流方向与压力流方向相反，出峰时间延长，各组分之间的分离度增大。此外，随着电压的越来越大，各组分的峰形开始变宽，出现拖尾现象。对比加电压和不加电压的情况，在不加电的情况下，大黄酸与甲醇溶剂峰重叠，因此，最终选择+5 kV作为样品的分离电压。

2.5 流动相流速的选择

流动相流速的大小直接影响柱压，进而影响各组分的洗脱速度及分离度。实验考察了不同流速(0.02，0.025，0.03，0.04，0.05 mL/min)下5种蒽醌类成分的分离效果，结果表明，流速越大，各组分的分析时间缩短，分离度下降，但当流动相流速较小时，溶质易扩散，导致峰形变差、变宽以及拖尾，综合考虑，实验选择泵流速为0.04 mL/min。

2.6 方法的线性关系与检出限

精密吸取100%混合标准溶液各1.0，0.5，0.25，0.2，0.1 mL，置于5 mL具塞离心管中，用适量甲醇稀释，配成100%，50%，25%，20%，10%系列浓度的混合标准溶液，旋涡振荡摇匀。根据“1.2.3”色谱分离检测条件进样，同一浓度重复进样3次，第一针的进样体积为40 μL，之后只需吸取同一样品5 μL。取3次平均峰面积(Y)，对标准品浓度(X，μg/mL)进行线性回归，得到5种成分的回归方程、线性范围、相关系数及检出限(S/N=3)见表1。5种成分的出峰情况如图3A。

表1 5种蒽醌类物质的线性关系及检出限Table 1 Linear relationships and limits of detection(LOD) of five anthraquinones

2.7 精密度实验

精密吸取浓度为20%混合标准溶液，在优化色谱条件下进样，重复进样6次，后5次进样每次只需取5 μL即可。测定5种组分的峰面积，计算得其相对标准偏差(RSD)为0.83%～2.4%。表明仪器精密度良好。

2.8 样品分析及加标回收率的测定

用进样针吸取适量“1.2.2”下处理好的样品，在最佳pCEC条件下平行进样3次，样品的pCEC图谱见图3B。测得虎杖样品中大黄素的含量为6.62 mg/g，大黄酚的含量为0.23 mg/g，大黄素甲醚的含量为4.10 mg/g。

取上述等体积的已知浓度的虎杖样品溶液3份，分别添加等体积浓度为20%，50%，100%混合标准溶液，进行加标回收实验，测定结果见表2。大黄素的回收率为91.6%～98.0%，大黄酚的回收率为91.1%～100.9%，大黄素甲醚的回收率为98.7%～101.2%，RSD值均小于4.0%。

表2 虎杖样品的加标回收率Table 2 Recoveries of polygonum cuspidatum sample

3 结 论

本文建立了检测5种蒽醌类成分的加压毛细管电色谱法，利用该方法对虎杖中蒽醌类物质进行了定性、定量分析，在12 min内实现了快速高效的分离。pCEC结合HPLC与CE的优点，克服了CEC的缺点，在电渗流和压力流的双重推动力下，样品的分离速度和分离效能显著提高。该方法的线性关系良好，精密度高，重复性好，满足分析检测的要求，且试剂消耗量小，为5种蒽醌类成分提供了一种简便快捷、经济环保的分析方法。

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Determination of the Main Anthraquinones in Root of Polygonum Cuspidatum by Pressurized Capillary Electrochromatography

XIAO Xiao-ru1，FENG Jun2,3,4，CHENG Hao1,2,3，HUANG Wen-yi1,2,3，LI Yan-qing1,2,3，ZHAO Yan-yong1，LI Li-jun1,2,3*

(1.College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Re-ources of Guangxi Higher Education Institutes，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；4.Medical College of Pharmacy，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545005，China)

A pressurized capillary electrochromatographic(pCEC) method was developed for the determination of the main anthraquinones,including rhein，emodin，aloe-emodin，chrysophanol and physcion in root of Polygonum cuspidatum.The separation was performed on a reversed-phase EP-100-20/45-3-C18column(total length of 45 cm,effective length of 20 cm，diameter of 100 μm，ODS packing inside for 3 μm).The mobile phase was composed of 20 mmol/L NaH2PO4(pH 4.7)-acetonitrile(15∶85) at a flow rate of 0.04 mL/min.Under the optimum conditions including running voltage of +5 kV，UV detection wavelength of 254 nm，the limits of detection(S/N=3)were in the range of 0.60-2.54 μg/mL for rhein，aloe-emodin，emodin，chrysophanol and physcion，respectively,and the linear detection ranges were 3.57-162.68 μg/mL with correlation coefficients not less than 0.998 2.The established method was used in the analysis of anthraquinones in polygonum cuspidatum with good results.The recoveries at three spiked levels ranged from 91.1% to 101.2%，with relative standard deviations(RSD) of 0.03%-3.6%.

pressurized capillary electrochromatography；polygonum cuspidatum；anthraquinone

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.016

2016-09-17；

2016-11-09

广西自然科学基金项目资助(2014GXNSFAA118402);广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划资助

O657.8;TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0388-05

*通讯作者：李利军，博士，教授，研究方向：加压毛细管电色谱，Tel：0772-2685028，E-mail：lilijun0562@sina.com