钙敏感受体通过PI3K/AKT通路对缺氧诱导的A549细胞增殖的影响*

李光伟， 苗宏志， 李 波， 沈云虹， 邱丽萍， 张亚珍， 金香兰， 朱坤杰△

(1齐齐哈尔医学院病理生理教研室， 2齐齐哈尔市第一医院胸心外科， 3齐齐哈尔医学院机能实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

钙敏感受体通过PI3K/AKT通路对缺氧诱导的A549细胞增殖的影响*

李光伟1， 苗宏志2， 李 波1， 沈云虹3， 邱丽萍3， 张亚珍3， 金香兰3， 朱坤杰3△

(1齐齐哈尔医学院病理生理教研室，2齐齐哈尔市第一医院胸心外科，3齐齐哈尔医学院机能实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的： 探讨钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)在缺氧诱导的A549及A549/DDP细胞增殖中的信号转导途径。方法: 通过缺氧培养箱内(93%N2、2% O2、5% CO2)培养24 h的方法复制细胞缺氧模型。应用Western blot技术分析PCNA及p-AKT蛋白不同处理情况下的表达水平；采用流式细胞技术检测不同处理因素对细胞周期及增殖指数的影响，应用BrdU掺入法分析不同处理因素对细胞DNA合成的影响。结果: 缺氧引起A549及A549/DDP细胞PCNA及p-AKT蛋白水平上调，增加 BrdU 掺入量、S期细胞数量和细胞增殖指数，GdCl3能够增强缺氧的作用，但上述效应可以被LY294002抑制。结论: PI3K/AKT信号通路在缺氧活化CaSR并促进A549及A549/DDP细胞增殖中起重要作用。

钙敏感受体； A549细胞； 缺氧； 细胞增殖； PI3K/AKT信号通路

近年来肺癌成为我国第一大癌症[1]，发病率和死亡率逐年提高。钙信号转导在肺癌发生中起重要作用，但其具体机制不详。钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)是1993年发现的一种G蛋白偶联受体[2]，在肿瘤的发生中发挥着重要作用，但它在肺癌中的作用未见报道。我们前期研究发现非小细胞肺癌组织中有CaSR蛋白的表达，其表达强度随肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤大小及淋巴结转移情况有关，提示非小细胞肺癌中CaSR的表达可能与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关[3]。为探究CaSR在肺癌增殖中的具体机制，我们以A549细胞为研究对象，做如下研究，以期为肺癌的临床防治提供新思路和新靶点。

材 料 和 方 法

1 细胞、主要试剂和仪器

人肺癌细胞系A549和A549/DDP购置于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

细胞周期试剂盒购置于Becton Dickinson；BrdU购置于Roche；抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、AKT和p-AKT的Ⅰ抗及Ⅱ抗均购自于Santa Cruz；细胞缺氧培养箱和酶标仪为Thermo产品；流式细胞仪为Becton Dickinson产品。

2 方法

2.1 实验分组及缺氧模型的复制 对照(control)组：细胞去血清培养24 h后，正常条件培养24 h；缺氧(hypoxia, H)组：细胞去血清培养24 h后，置于细胞缺氧培养箱内培养24 h (93% N2、2% O2、5% CO2)；GdCl3干预组(H+GdCl3组)：细胞去血清培养24 h，加入GdCl3(300 μmol/L)后，置于细胞缺氧培养箱内培养24 h；LY294002干预组(H+LY组)：细胞去血清培养24 h，加入LY294002(10 μmol/L)孵育30 min后加入GdCl3(300 μmol/L)，置于缺氧培养箱内培养24 h。

2.2 Western blot分析CaSR、PCNA、AKT和p-AKT的蛋白水平 A549及A5459/DDP细胞刮下后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，12 000 r/mim 4 ℃离心 20 min，取上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE分离蛋白，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，封闭液中封闭1 h； 分别加入PCNA(1∶500)、AKT(1∶500)、p-AKT (1∶500)和GAPDH(1∶500)I抗，4 ℃过夜。洗膜，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)标记的抗IgG抗体(1∶1 000)孵育1 h，最后用显色剂(Promega)显色，吸光度扫描半定量分析显影条带[4-6]。

2.3 流式细胞术检测细胞增殖周期 分别取各组细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤，调整细胞密度为1×106/L，制成单细胞悬液，2 000 r/min离心5 min，PBS洗涤，2 000 r/min离心5 min，加3 mL预冷的乙醇固定，4 ℃过夜，2 000 r/min离心5 min，加入缓冲液3 mL洗涤，2 000 r/min离心5 min，加A液(trypsin buffer)250 μL，室温作用10 min，加B液(trypsin inhibitor and RNase buffer)200 μL，室温作用10 min，加预冷的C液(PI stain solution)200 μL，室温避光10 min，上机检测[7]。

2.4 DNA BrdU掺入法测定细胞增殖 细胞种在96孔板上，每孔3 500个。各组细胞去血清培养24 h后按照实验方法2.1分别给药及复制模型，每孔加入BrdU标记的溶液(10 μmol/L)，固定60 min，过氧化物酶标记的抗BrdU抗体(1∶100)室温孵育90 min，细胞冲洗3次，底物溶液室温孵育5 min， 酶标仪测定450 nm波长处吸光度(A)值[7]。

3 统计学处理

统计学处理使用 SPSS 17.0软件。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检测。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同处理因素对CaSR表达的影响

与对照组比较，缺氧组CaSR表达增加(P<0.05)，GdCl3能增加其表达(P<0.05)，NPS2390(CaSR抑制剂)的作用相反，A549/DDP细胞与A549细胞CaSR蛋白表达结果一致,见图1。

Figure 1. The protein expression of CaSR determined by Western blot in different groups of the A549 and A549/DDP cells. H： hypoxia. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group.

2 不同处理因素对PCNA表达的影响

在A549及A549/DDP细胞中，缺氧组PCNA蛋白表达增加(P<0.05)；缺氧基础上GdCl3能上调这种增加(P<0.05)；LY294002(PI3K抑制剂)则能够抑制PCNA的表达上调(P<0.05),见图2。

Figure 2. The protein expression of PCNA determined by Western blot in different groups of the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia； LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

3 不同处理因素对细胞周期及细胞增殖指数的影响

在A549细胞，与control组比较，缺氧组G0/G1期细胞比例显著降低，S和G2/M期细胞比例均显著增加。细胞增殖指数 (proliferation index，PI) 计算结果显示，缺氧状态下PI比对照组增加，是对照组的1.34倍(P<0.05)；而H+GdCl3组S和G2/M期细胞比例明显增加，PI值明显增高，达到30.55，高于缺氧组(P<0.05)；LY294002可抑制缺氧诱导的A549细胞增殖，PI指数回落到20.48。A549/DDP细胞的变化趋势与A549细胞一致，见图3。

Figure 3.The cell cycle analysis by flow cytometry in the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

4 不同处理因素对BrdU掺入量的影响

对照组BrdU掺入量作为100%，其它组的BrdU掺入量表示为对照组的百分数。A549和A549/DDP细胞结果均显示，与对照组相比，缺氧组的BrdU掺入量增加(P<0.05)；而H+GdCl3组的BrdU掺入量显著高于缺氧组(P<0.05)； LY294002可抑制缺氧和GdCl3诱导的细胞增殖，BrdU掺入量降低(P<0.05),见图4。

Figure 4. The cell proliferation determined by BrdU incorporation assay in the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

5 不同处理因素对p-AKT蛋白水平的影响

2种细胞Western blot检测结果显示，和对照组比较，缺氧能够上调p-AKT蛋白的水平(P<0.05)；缺氧基础上GdCl3能够进一步增加p-AKT蛋白的水平(P<0.05)；这种促进效应可以被PI3K通路阻断剂LY294002抑制(P<0.05),见图5。

讨 论

肺癌居恶性肿瘤发病率之首，严重威胁着人类的健康。目前我国已为世界第一肺癌大国，因此肺癌的诊断和治疗已成为我国临床工作者必须面临的严峻挑战。钙离子作为细胞内重要的信息分子可以激活不同的信号通路，参与许多重要生命活动的调节。恶性肿瘤发生发展过程常伴随钙离子信号的异常，但其发生机制不甚清楚。因此，认识肺癌发生、发展的分子机制，对于改善患者预后，提高其生存质量有重要意义。

CaSR是细胞膜上一种G蛋白偶联受体。1993年Brown等[2]首先从牛的甲状旁腺中克隆出来。在体内分布广泛，功能主要是维持Ca2+和其它金属离子稳态，此外在细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡、基因表达、维持膜电位、离子通道开关、衰老等过程中亦发挥重要作用[8]。大量研究表明，其在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。CaSR是影响乳腺癌预后的独立风险因子[9-11]。我们前期研究发现非小细胞肺癌组织中有CaSR蛋白的表达，其表达强度随肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤大小及淋巴结转移情况有关，提示非小细胞肺癌中CaSR的表达可能与肿瘤细胞的增殖及侵袭、转移密切相关[3]。但其具体机制如何，目前未见报道。

Figure 5.The protein levels of p-AKT in the A549 and A549/DDP cells determined by Western blot. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; # P<0.05 vs H+GdCl3 group.

缺氧是实质性肿瘤物理微环境的基本特征之一，研究证实缺氧能够活化多种细胞上的CaSR[12-13]。实验中我们观察到缺氧能够上调A549及A549/DDP细胞钙敏感受体蛋白的表达，GdCl3能够加强缺氧的作用，而NPS2390能减弱缺氧的作用，说明缺氧能够活化A549及A549/DDP细胞的CaSR。

研究证实,CaSR基因敲除可导致体外细胞增殖和体内骨转移的进程减慢[14]。我们对增殖指标评估的结果显示：缺氧促进PCNA蛋白的表达，增加BrdU掺入量，能够使S期细胞数量增多，细胞增殖指数增加。上述这些作用能够被CaSR激动剂GdCl3所增强，提示缺氧活化的CaSR可能参与了A549及A549/DDP细胞的增殖活动。

PI3K/AKT通路是细胞增殖的经典信号途径之一，为进一步探索其在缺氧活化CaSR促进A549细胞增殖的作用，我们使用了PI3K信号通路的抑制剂LY294002进行实验。结果显示LY294002能够减弱GdCl3所引起的细胞增殖作用，表现为BrdU掺入量，S期细胞数量均减少，细胞增殖指数降低；蛋白检测结果显示：缺氧能够增加p-AKT蛋白水平，GdCl3能增强缺氧的作用，被LY294002所减弱。这些结果均提示PI3K/AKT信号通路在缺氧活化CaSR促进A549及A549/DDP细胞增殖中起重要作用。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Calcium-sensing receptor mediates hypoxia-induced proliferation of A549 cells through PI3K/AKT pathway

LI Guang-wei1, MIAO Hong-zhi2, LI Bo1, SHEN Yun-hong3, QIU Li-ping3, ZHANG Ya-zhen3, JIN Xiang-lan3, ZHU Kun-jie3

(1DepartmentofPathophysiology,QiqiharMedicalUniversity,2DepartmentofThoracicandCardiovascularDisease,TheFirstHospitalofQiqihar,3DepartmentofFunctionalLaboratory,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China.E-mail: 1102044987@qq.com)

AIM: To explore the cell signal transduction pathway of calcium-sensing receptor (CaSR) mediating hypoxia-induced proliferation of A549 cells and A549/DDP cells. METHODS: The cell proliferation was tested by BrdU incorporation assay. The cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. The protein levels of PCNA and p-AKT were analyzed by Western blot. RESULTS: Hypoxia significantly increased the protein levels of PCNA and p-AKT, the BrdU incorporation and the cell proliferation index. GdCl3(an agonist of CaSR) amplified the effect of hypoxia. LY294002 (a PI3K inhibitor) decreased the up-regulation of PCNA expression, the BrdU incorporation and the increased cell proliferation index induced by hypoxia and GdCl3in the A549 cells and A549/DDP cells. CONCLUSION: CaSR is expressed in A549 cells and 549/DDP cells, and CaSR activation induced by hypoxia promotes the proliferation of A549 cells and A549/DDP cells through PI3K/AKT signaling pathway.

Calcium-sensing receptor; A549 cells; Hypoxia; Cell proliferation; PI3K/AKT signaling pathway

1000- 4718(2017)03- 0505- 05

2016- 10- 09

2016- 12- 05

齐齐哈尔医学院博士基金资助项目(No. QY2016B-16)

△通讯作者 Tel： 0452-2663161; E-mail: 1102044987@qq.com

R363；R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.020