硫化氢对FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓模型中凝血和纤溶活性的影响*

卞冬燕， 刘红旭， 梁钰敏， 王 垚， 吴红婷， 李朋朋， 黄琳燕

(徐州医科大学医学技术学院，江苏 徐州 221004)

硫化氢对FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓模型中凝血和纤溶活性的影响*

卞冬燕， 刘红旭， 梁钰敏， 王 垚， 吴红婷， 李朋朋， 黄琳燕△

(徐州医科大学医学技术学院，江苏 徐州 221004)

目的： 探讨外源性硫化氢(H2S)对三氯化铁(FeCl3)诱导的小鼠颈动脉血栓模型凝血和纤溶活性的影响。方法: 本实验分为空白对照组、模型组、不同浓度(12.5、25和50 μmol/kg)的硫氢化钠(NaHS，H2S供体)处理组和30 mg/kg氯吡格雷(clopidogrel，阳性对照)。不同浓度NaHS腹腔注射及硫酸氢氯吡格雷灌胃给药处理3 d后，采用10% FeCl3诱导小鼠颈动脉血栓模型。取各组颈动脉制成冰冻切片后，HE染色观察血栓形成及血管病理变化；对形成的血栓重量进行测量，计算血栓形成抑制率；采用血凝仪检测血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)和纤维蛋白降解产物(FDP)的变化；ELISA法检测血浆中血栓烷素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)和纤溶酶原活化抑制剂(PAI)的含量。结果: 与模型组相比，NaHS剂量依赖性地抑制小鼠颈动脉血栓的形成；NaHS处理可延长血栓模型中PT和APTT，减少FIB含量，增加FDP含量；NaHS处理能够降低颈动脉血栓模型中TXB2及PAI含量，恢复6-keto-PGF1α含量，并且6-keto-PGF1α/TXB2与血栓重量呈负相关。结论: 硫化氢通过抑制机体凝血功能并激活纤溶活性而抑制FeCl3诱导的颈动脉血栓形成。

硫化氢； 血栓； 凝血； 纤溶； 血栓烷素B2

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)作为一种气体信号分子参与许多生物学过程。大量研究证实H2S在神经系统、消化系统、泌尿系统、心血管系统等中发挥着各种生理和病理作用[1-5]。在心血管系统中，H2S发挥舒张血管、促进血管新生、抑制血管平滑肌细胞增殖并调控其表型转化[6]、调节血管平滑肌细胞酸化[7]、抑制血管内皮细胞炎症和退化反应[8]等生物学效应。在大鼠心肌缺血模型中，硫化氢通过抑制核因子κB活性减少肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6， IL-6)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎性细胞因子的表达从而减轻心肌缺血对机体造成的损伤[9]。同时，硫化氢还能够通过糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)/β-联蛋白(β-catenin)信号途径介导抗心肌细胞凋亡作用[10]。此外，硫化氢能够抑制血小板功能，包括血小板黏附、分泌和聚集[11-14]。已有研究表明，硫化氢可以抑制三氯化铁(ferric chloride，FeCl3)诱导的小鼠颈动脉血栓形成，但是其发挥作用的具体机制尚不明确。本研究通过检测H2S对FeCl3诱导的颈动脉血栓模型小鼠凝血和纤溶活性指标的变化，探讨H2S抑制血栓形成的机制。

材 料 和 方 法

1 材料

水合氯醛、硫氢化钠和三氯化铁购自Sigma；硫酸氢氯吡格雷购自Sanofi；多聚甲醛和疏水性载玻片购自徐州微科曼得公司；蔗糖、ACD抗凝剂(120 mmol/L枸橼酸纳，110 mmol/L葡萄糖，80 mmol/L枸橼酸，pH=7.4)和二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司；中性树脂购自上海标本模型厂。冰冻切片机(Leica)；光学显微镜(Olympus)；酶标仪(Bio-Rad)；血凝仪(Sysmex CA1500)。

2 方法

2.1 动物分组和模型建立 将购买于徐州医科大学实验动物中心的8～10周龄健康雄性小鼠，体重(22±2)g，共120只。随机分为空白对照组、模型组、NaHS(12.5 μmol/kg) I组、NaHS (25 μmol/kg)II组、NaHS (50 μmol/kg)III组和氯吡格雷(clopidogrel，30 mg/kg)组共6组，每组20只。连续3 d每日定时给予NaHS或生理盐水(0.9% NaCl溶液，溶剂对照)腹腔注射，造模当日，水合氯醛麻醉成功后取仰卧位，颈部正中线做直线切口，暴露右侧颈总动脉，于动脉下垫塑料薄膜保护周围组织。取Whatman滤纸，裁成1.2 cm×0.8 cm大小，10% FeCl3浸透后覆盖暴露的血管2.5 min后，移去滤纸，生理盐水冲洗3遍。

2.2 血栓称重 FeCl3造模成功，暴露的血管经生理盐水冲洗后，于包含血栓的血管上下两端结扎血管，剪断后放入EP管中，称取血管和血栓总重量，而后用小镊子轻轻将血管内血栓取出，称取血管重量，两者差值即为血栓湿重量。最后计算血栓形成抑制率=(A-A1)/A×100%，其中A代表模型组血栓质量，A1代表其它各处理组血栓质量。

2.3 苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色 经FeCl3处理造模成功后的小鼠，打开胸腔暴露心脏，沿左心室上行进入主动脉，同时剪开右心耳，持续用压强约100 mmHg的PBS冲洗小鼠全身血管，观察小鼠肝脏发白时，接着用冷的4%的多聚甲醛进行灌注15 min左右。灌注结束后剪取颈动脉血管制成冰冻切片，切片厚度约6 μm，按照步骤[15]进行HE染色，封片后在显微镜下进行形态观察。采用Image-Pro Plus图像处理软件测定颈动脉血栓形成面积。

2.4 凝血指标和纤溶活性指标测定 小鼠心脏穿刺取血，迅速加入枸橼酸钠抗凝管(9∶1)，4 ℃ 3 000 r/min 离心15 min，得到上层血浆，利用血凝仪检测凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)和纤维蛋白降解产物(fibrinogen degradation product，FDP)变化，1 h内完成检测。

2.5 ELISA实验 小鼠心脏取血离心得到上层血浆，采用酶联免疫试剂盒，按照说明书手工测定小鼠血浆中血栓烷素B2(thromboxane B2, TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-prostaglandin1α, 6-keto-PGF1α)和纤溶酶原活化抑制剂(plasminogen activator inhibitor, PAI)的含量，操作时每个样本测定2个孔，结果取平均值。分光光度计测定相应的浊度后，根据各自的浓度标准曲线计算各待测样本的浓度。

3 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件处理数据，所有计量资料均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，并采用SNK-q法进行两两比较，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 H2S抑制FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓形成

通过称量各组血栓的湿重，我们发现正常组没有血栓，模型组颈动脉血栓重量明显增加，NaHS各剂量组血栓重量依次减少，硫酸氢氯吡格雷与25 μmol/kg NaHS具有相同的作用。HE染色结果显示，正常组血管内膜完整，模型组有明显血栓形成，血管内膜破坏严重。与模型组相比，NaHS各剂量组血栓依次减少。计算各组血栓面积结果显示，硫氢化钠处理后，血栓面积明显较模型组减少，提示H2S抑制FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓形成，见图1、表1。

Figure 1.NaHS inhibited FeCl3-induced carotid artery thrombosis in a dose-dependent manner. Representative HE staining images of carotid artery thrombus in different groups were showed (×200).

表1 不同浓度硫氢化钠对 FeCl3诱导的颈动脉血栓形成的影响

*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

2 H2S对 FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓模型中凝血指标和纤溶活性指标的影响

通过检测各组凝血指标和纤溶活性指标发现，与假手术组相比，FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓模型组PT和APTT均明显缩短，而NaHS处理后可分别延长PT和APTT。与假手术组相比，模型组FIB和FDP含量明显增加，而NaHS处理后可减少FIB，但FDP含量增加更明显，见表2。

3 H2S改变FeCl3诱导的血栓模型中6-keto-PGF1α/TXB2比值以及恢复PAI水平含量

实验结果显示，与对照组相比，模型组TXB2和PAI水平显著增加，而6-keto-PGF1α的含量明显减少；与模型组相比，NaHS剂量依赖性地降低TXB2和 PAI水平，增加6-keto-PGF1α的含量，见表 3。

表2 不同浓度硫氢化钠对 FeCl3诱导小鼠颈动脉血栓模型中凝血指标和纤溶活性指标的影响

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

通过计算6-keto-PGF1α/TXB2的比值发现，与模型组相比，NaHS剂量依赖性地增加6-keto-PGF1α/TXB2，与血栓重量呈负相关(y=-0.0304x+0.2089，R2=0.8505)，见图2。

讨 论

表3 不同浓度硫氢化钠对FeCl3诱导颈动脉血栓模型中6-keto-PGF1α、TXB2及PAI的影响

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

Figure 2.The correlation analysis between thrombus weight and the ratio of 6-keto-PGF1α/TXB2. y=-0.0304x+0.2089, R2=0.8505.

FeCl3诱导的颈动脉血栓是应用广泛的血栓模型[16]，通过氧化损伤血管内皮引起血小板黏附和聚表3 不同浓度硫氢化钠对FeCl3诱导颈动脉血栓模型中6-keto-PGF1α、TXB2及PAI的影响集，导致血栓形成[17]。该模型对抗凝和抗血小板药物敏感，已经在多种实验性动物的动、静脉上得到应用[18-19]。本研究中，我们通过称量颈动脉血栓湿重，以及计算各组血栓抑制率，发现硫化氢具有抗血栓作用，并且高剂量NaHS作用更明显，这与先前的报道有差异[20]，可能与大小鼠模型对硫化氢的反应性不一致有关。FeCl3诱导的颈动脉血栓模型组PT和APTT缩短，提示机体处于高凝状态，而硫化氢处理可延长凝血时间。在凝血系统被激活后，FIB被凝血酶水解后形成纤维蛋白单体，后者交联成稳定的纤维蛋白多聚体；同时纤溶系统被激活，纤维蛋白在纤溶酶作用下降解成各种FDP，其中最小的片段为D-二聚体[21]。由于模型组中FIB含量增加，由于机体处于高凝状态，已激活纤溶酶产生FDP，因此模型组FDP增加，而硫化氢处理后进一步激活机体纤溶系统，由FIB降解产生的FDP含量进一步增加。提示硫化氢可通过抑制凝血和激活纤溶系统抑制三氯化铁诱导的血栓形成。PGI2和TXA2均是花生四烯酸的代谢产物，能够动态调节血小板活化和血管张力。PGI2是一种有效的内源性血管扩张剂和血小板聚集抑制剂，能有效防止血小板黏附和聚集，并且通过保护血管内皮细胞的生物活性来抑制血栓形成。TXA2是血管重建和血小板聚集的有效诱导剂，并在血栓形成过程中起着关键作用[22]。在生理条件下，TXA2和PGI2维持血管张力和血液流变学的体内平衡。如果TXA2的合成增加，PGI2合成减少，TXA2/PGI2失去平衡，则会引起血管收缩，血小板黏附和聚集，进而血栓生成，并进一步导致动脉粥样硬化，冠状动脉痉挛，冠状动脉血栓和心肌梗死[23- 24]。TXA2和PGI2是不稳定的，所以我们通过检测相应的稳定代谢物TXB2和6-keto-PGF1α来反映TXA2和PGI2的水平。PAI-1是纤溶系统的主要调节剂。血浆过多的PAI-1使PA活性降低，进而降低纤溶活性，促进血栓形成。因此，我们通过检测这些指标发现，模型组血浆中TXB2和PAI-1含量大大增加，6-keto-PGF1α显著减少，血栓形成增多，并且6-keto-PGF1α/TXB2的比值与血栓重量呈负相关。而NaHS处理后明显降低模型组中TXB2和PAI-1含量，增加6-keto-PGF1α含量，恢复6-keto-PGF1α/TXB2的比值。本实验为研究硫化氢预防和治疗血栓性疾病提供新的实验依据。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Effect of hydrogen sulfide on coagulation and fibrinolysis in FeCl3-induced mouse carotid artery thrombosis model

BIAN Dong-yan, LIU Hong-xu, LIANG Yu-min, WANG Yao, WU Hong-ting, LI Peng-peng, HUANG Lin-yan

(MedicalTechnologyCollege,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China.E-mail:huangly1985@xzhmu.edu.cn)

AIM: To explore the influence of exogenous hydrogen sulfide (H2S) on coagulation and fibrinolysis in ferric chloride (FeCl3)-induced mouse carotid artery thrombosis. METHODS: The mice were divided into sham control group, model group, different concentrations (12.5, 25 and 50 μmol/kg) of sodium hydrosulfide (NaHS, H2S donor) groups and 30 mg/kg clopidogrel (positive control) group. Intraperitoneal injection of NaHS at different concentrations and oral administration of clopidogrel bisulfate were performed for 3 d prior to FeCl3-induced carotid artery thrombosis. The frozen sections of the carotid artery were collected to perform HE staining, and the thrombus pattern and the changes of vascular pathology were observed. The thrombus was weighed to calculate thrombosis inhibitory rate. Prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), fibrinogen (FIB) and fibrinogen degradation product (FDP) in the mice were also measured by a coagulometer. The plasma levels of thromboxane B2(TXB2), 6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α) and plasminogen activator inhibitor (PAI) were detected by ELISA. RESULTS: Compared with model group, NaHS dose-dependently inhibited the formation of carotid artery thrombus. NaHS treatment reduced the contents of TXB2and PAI, and recovered 6-keto-PGF1αcontent in thrombosis model group. In NaHS treatment groups, 6-keto-PGF1α/TXB2and thrombus weight was negatively correlated. NaHS treatment prolonged PT and APTT, reduced the content of FIB, but increased the level of FDP in thrombosis model group.CONCLUSION: Hydrogen sulfide prevents FeCl3-induced carotid artery thrombosis by inhibiting coagulation and activating fibrinolysis.

Hydrogen sulfide; Thrombus; Coagulation; Fibrinolysis; Thromboxane B2

1000- 4718(2017)03- 0523- 05

2016- 06- 27

2017- 01- 12

国家自然科学基金青年项目(No. 81402918)；江苏省科技厅青年项目(No.BK20140228)； 2014年大学生创新创业训练计划(No.201410313072X)

△通讯作者 Tel: 0516-83262995; E-mail: huangly1985@xzhmu.edu.cn

R363; R543

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.023