荣肝汤对二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化的干预作用研究

谢林钦，朱冠保，黄 登

荣肝汤对二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化的干预作用研究

谢林钦1,2，朱冠保1，黄 登3

目的：观察荣肝汤对二甲基亚硝胺（DMN）诱导的大鼠肝纤维化的干预作用。方法：35只Wista雄性大鼠随机分为对照组和造模组，以0.5%DMN按2 mL/kg体质量腹腔注射4周复制大鼠肝纤维化模型，后将造模组大鼠随机分为模型组，荣肝汤组，灌胃相应药物3周。7周末处死动物，留取标本，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和白蛋白(Alb)、总胆红素(TBIL)含量；测定肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量。HE染色和天狼猩红染色观察肝组织病理学改变。蛋白印迹法检测大鼠肝组织I型胶原和alpha平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平。结果：与正常组比较，模型组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平明显升高（P＜0.05），Alb含量显著下降（P＜0.05），经荣肝汤干预后，血清学肝功能指标显著改善。HE染色显示模型组肝脏内有大量炎性细胞浸润，肿胀、变性坏死，有明显出血现象；天狼猩红染色显示模型组大鼠肝脏胶原增生明显，形成假小叶，胶原面积明显增加。模型组肝组织Hyp含量较正常组明显升高[（1412.42±367.68）μg/g VS(530.20±62.37)μg/g，P＜0.01]，肝组织Ⅰ型胶原抗体、α-SMA蛋白表达水平显著升高；药物干预后肝组织炎症和纤维化程度较模型组均有所改善，肝组织Hyp含量明显降低[(1092.83±146.19)μg/g]。统计分析显示荣肝汤组与模型组比较肝组织胶原面积明显减轻[(358 810± 235 058)×104μm2VS(358 810±235 058)×104μm2,P＜0.05]，肝组织Ⅰ型胶原抗体、α-SMA表达水平明显降低。结论：荣肝汤对DMN诱导的大鼠肝纤维化有较好的逆转作用。

荣肝汤；肝纤维化；二甲基亚硝胺；生化指标；病理学变化

荣肝汤是全国著名老中医、著名中医肝病专家关幼波用于治疗慢性肝炎、早期肝硬化，证属肝郁脾虚、气滞血瘀的验方[1]，已有多项临床实验研究证实[2-3]该方可用于肝纤维化的治疗。本文复制大鼠二甲基亚硝胺肝纤维化模型，用以观察荣肝汤对模型大鼠肝纤维化的干预作用，为该方的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和药物 Wista雄性大鼠35只，体质量（190±9）g，清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK（京）2007-0001，饲养于温州医科大学实验动物中心，12 h光照和12 h黑暗交替，自由进食及饮水。

荣肝汤由党参12 g，炒白术10 g，炒苍术10 g，木香10 g，茵陈15 g，当归12 g，白芍12 g，香附10 g，佛手10 g，山楂15 g，泽兰15 g，生牡蛎15 g，王不留行12 g组成。药物采用江苏天江药业有限公司免煎颗粒制剂产品，用时采用原方配比，煎煮15 min备用。

1.2 主要试剂和仪器 二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine,DMN），Cat.No.MAL05，为东京化成工业株式会社产品；二甲苯，甲醛，无水乙醇，分析纯；中性树胶，均购自中国医药集团上海化学试剂公司。肝功能检测试剂、苏木素伊红染料，羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒，均为南京建成生物制品研究所产品。预染蛋白标准品为Fermentas公司产品；BCA蛋白定量试剂盒THERMO公司产品，硝酸纤维素膜为Millipore公司产品；脱脂奶粉为Nestle公司产品；ECL化学发光试剂盒购自PIERCE公司；多克隆α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原抗体均为Abcam公司产品；单克隆GAPDH抗体为康成生物公司产品。自动脱水机、石蜡包埋机、轮转切片机、烤片机、均为德国Leica公司。光学显微镜，日本Olympus公司产品；POWER/PAC200电泳系统，美国BIO-RAD公司制造；连续波长酶标仪酶标仪，美国BIO-TEK公司产品。

1.3 造模与用药方法 参考文献[4]方法，大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组10只，造模组25只。造模组以含0.5%DMN的生理盐水按2 mL/kg体质量腹腔注射，首次注射全剂量的2/3，1次/d，连续注射3 d后休息4 d，共3周。第4周的第1 d和第3 d注射1/2量，中间停1次，3 d后再注射全量1次。正常组大鼠予相同的时间和部位腹腔注射等量的生理盐水。造模第3、4周末分别处死1只大鼠，观察肝纤维化形成情况。造模完成后正常组老鼠共8只，模型组老鼠共19只。

造模4周后，称取造模组大鼠体质量，按体质量排序后，采用分层随机的方法分为模型组10只，荣肝汤组9只（相当60 kg成人体质量用量的8倍量）。分别灌胃相应药物，1次/d，共3周。正常组和模型组灌胃等剂量饮用水。

1.4 指标检测

1.4.1 样本收集 7周末，大鼠禁食不禁水12 h后，采用20%乌拉坦麻醉，腹主动脉采血。血液4℃下静置2 h后，3000 r/min，15 min离心，取上清分装于1.5 mL离心管，-80℃保存。动物取血处死后，取下肝脏和脾脏称重量，然后取约1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm大小肝组织2块，于10%中性甲醛溶液中固定。-80℃保留2管肝组织用于Hyp测定。

1.4.2 生化指标 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、白蛋白(ALB）和总胆红素（TBIL）均采用南京建成生物制品研究所试剂盒方法检测。Hyp含量测定采用南京建成生物技术公司试剂盒测定，操作步骤参照说明书进行。

1.4.3 病理学观察 甲醛固定的肝组织于24 h后逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm切片，用于HE、天狼猩红染色，观察肝组织炎症和纤维化胶原沉积情况，专业图像分析软件ipp6.0测量胶原面积（μm2）。

1.4.4 肝组织Ⅰ型胶原抗体、α-SMA蛋白表达检测 称取各样本肝组织100 mg加1 mL组织裂解液，冰水浴匀浆后冰上裂解30 min，12 000 r/min，离心15 min，取上清即组织总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg总蛋白于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将凝胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入Ⅰ抗［GAPDH抗体(1∶10 000)、α-SMA抗体(1∶5000)、Ⅰ型胶原抗体（1∶500）］，4℃孵育过夜，洗涤后加入相应二抗（1∶5000）室温孵育1 h后，ECL底物化学发光显色后曝光显影。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计分析软件处理。本研究计量资料用均数±标准差(±s)描述，3组间比较采用方差分析，计数资料用率表示，采用精确概率法分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠生长良好，毛色光滑，体重逐渐增加，DMN造模大鼠表现为食欲降低，体型瘦弱，毛蓬松，体重较正常组明显减轻，荣肝汤组情况较模型组有所好转。至第4周末开始，部分大鼠可见腹部膨大，有腹水形成。4周末解剖观察模型大鼠肝脏缩小，质地变硬，提示造模成功。从完成造模开始至7周末，各组大鼠死亡和腹水形成情况见表1，各组腹水形成率无统计学差异（Fisher的精确检验值4.332,P=0.094）。

表1 各组大鼠死亡及腹水发生情况

2.2 各组大鼠肝重、脾重、肝体比及脾体比比较 模型组大鼠与正常组比较，体重、肝重及肝体比明显下降，脾重和脾体比显著增加。经荣肝汤干预，大鼠体重、肝重和肝体比有所增加，但无统计学差异，脾体比与模型组相比显著降低（见表2）。

表2 各组大鼠体重、肝重、脾重情况(±s)

表2 各组大鼠体重、肝重、脾重情况(±s)

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别正常组模型组荣肝汤组n8 1 0 9体质量(g) 346.62±15.33 237.25±14.65a253.56±21.16a肝重(g) 11.47±0.75 5.03±0.45a6.52±0.97a脾重(g) 0.65±0.05 1.18±0.14a0.91±0.12a肝体比0.033±0.00 0.023±0.00a0.025±0.00a脾体比0.0018±0.00 0.0042±0.00a0.0035±0.00a、b

2.3 各组大鼠血清生化学指标比较 与正常组大鼠相比，模型组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平明显升高（P＜0.05），Alb水平明显下降（P＜0.05）。经荣肝汤药物干预后，血清学指标均有所降低，Alb水平有所升高（见表3）。

表3 各组大鼠血清生化学指标(±s)

表3 各组大鼠血清生化学指标(±s)

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别正常组模型组高剂量组n8 1 0 9 TBIL（mmol/L）4.02±0.21 13.45±4.62a10.43±4.38 ALT（IU/L）61.45±12.23 239.33±25.86a132.77±17.21bAST（IU/L）112.26±31.18 403.97±50.29a241.25±37.62bAlb（g/L）29.45±1.51 19.28±3.89a23.56±2.48b

2.4 各组大鼠肝组织病理学变化 光学显微镜下观察，正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝板排列整齐，肝细胞无变性坏死，肝窦未见狭窄或扩张；模型组大鼠肝脏内可见大量炎性细胞浸润，肝窦狭窄并充血，汇管区扩大，肝板排列紊乱，肝细胞表现为肿胀、变性坏死；与模型组相比，荣肝汤组大鼠的肝细胞变性坏死、出血、炎症细胞浸润等病理变化有不同程度的改善（见图1）。

图1 各组肝组织HE染色（×200）

肝组织天狼猩红染色观察：正常组大鼠仅在大血管周围见少量胶原纤维；模型组大鼠肝脏胶原增生明显，大量的假小叶纤维间隔，分割包绕肝组织；治疗组肝脏的纤维化程度较模型组明显的改善（见图2）。胶原面积半定量分析，与正常组比较，模型组胶原面积显著增加，比较有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，荣肝汤组大鼠肝组织胶原面积显著减少（P＜0.05）。肝组织Hyp含量显示结果与胶原面积相同的趋势（见表4）。

图2 各组肝组织天狼猩红染色（×100）

表4 各组肝组织胶原面积和Hyp含量（mean±SD）

2.5 各组大鼠肝组织Ⅰ型胶原抗体、α-SMA蛋白表达变化 蛋白印迹法检测结果可见，模型组大鼠肝组织各组Ⅰ型胶原抗体、α-SMA蛋白表达水平较正常组显著增加，经荣肝汤干预后，2个蛋白表达水平均明显降低（见图3）。

图3 各组大鼠肝组织Ⅰ型胶原抗体、α-SMA蛋白表达

3 讨论

慢性肝病是指肝炎病毒、乙醇、药物与毒物、代谢和遗传、胆汁淤积、免疫异常等病因所致的病程超过半年的各种肝病。肝脏内长期病因刺激可导致肝组织的损伤，从而启动肝纤维化发生机制，因此，肝纤维化是存在于大多数慢性肝脏疾病过程中的病理变化，其主要特征是肝组织内细胞外基质（ECM）的过度增生与沉积，肝纤维化的持续存在，伴随正常肝实质细胞的坏死和凋亡而ECM不断累积，最终可形成肝硬化，严重威胁患者的生存质量[5-6]。对于肝纤维化的治疗，首要策略是病因治疗，如长期有效抑制肝炎病毒复制、戒酒等可减轻肝脏持续损伤，从而促进纤维化肝组织的修复[7]。但仍有一些患者在控制了病因的情况下，肝纤维化仍持续存在，病情继续进展，最终发展为肝硬化或肝癌[8]。因此，对于肝纤维化，除了病因治疗，抗肝纤维化治疗也是重要的治疗手段[9]。肝纤维化目前尚没有明确的西药可用[10]，而中医药具有多成分、都环节和多靶点的特点，在治疗中具有显著的优势[11]，已有包括扶正化瘀胶囊、鳖甲软肝片、安络化纤丸在内的多个抗肝纤维化中成药用于临床[12-13]。

中医将肝纤维化归为“胁痛”、“黄疸”、“积聚”等范畴，血瘀是其形成的重要病机。因此，中医推荐以活血化瘀中药为基础的治疗方法贯穿肝病治疗的始终[14]。荣肝汤是著名中医肝病专家关幼波用于治疗慢性肝炎、早期肝硬化，证属肝郁脾虚、气滞血瘀的验方。方中党参、白术健脾益气，培土荣木；苍术、木香醒脾化湿；茵陈清热解毒、利湿退黄；香附、佛手舒肝理气；当归、白芍养血柔肝；山楂、泽兰、王不留行活血化瘀；牡蛎软坚散结。诸药合用，脾土得健，湿法得化，热毒得清，瘀血得解，而收本固标去、正复邪除之效[1]。名老中医用于治疗疾病的经验方是中医前辈在中医辩证基础上与现代医学疾病认识相结合制定的有效方剂[15]，临床上常取得良好的效果。荣肝汤作为关幼波老中医治疗早期肝硬化的经验方，既往研究发现，慢性乙型肝炎患者服用荣肝汤3个月后，可明显改善患者肝功能，并减轻透明质酸、Ⅲ型前胶原等肝纤维化血清学指标[2]。黎俊民等[3]在荣肝汤基础上加减用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化50例也取得了良好疗效。这些研究成果提示荣肝汤对肝纤维化可能具有较好的治疗作用。

本研究采用腹腔注射二甲基亚硝胺的方法制作大鼠肝纤维化模型，利用生物化学和分子生物学等技术方法观察了荣肝汤对该模型的干预作用，并初步探讨了荣肝汤治疗肝纤维化的潜在作用机制。研究发现，荣肝汤可以改善肝纤维化大鼠肝功能指标和减缓肝细胞病理性改变。更重要的是，蛋白印迹结果显示荣肝汤可降低I型胶原蛋白和α-SMA表达病因学研究已经证实肝星状细胞的增生或激活是肝纤维化发生的中心环节，并导致ECM的过量合成，促进肝纤维化。本研究结果提示荣肝汤可能通过有效抑制肝星状细胞增殖及活化，降低肌成纤维样细胞的生成，发挥抑制ECM介导的肝纤维化作用。这为揭示荣肝汤抗纤维化的有效作用和机制提供了重要基础研究依据。

本研究结果为临床肝纤维化的治疗提供了新的方向和线索，也为深入开展临床研究提供了理论和研究依据。肝纤维化的发生和发展机制十分复杂，荣肝汤具有活血化瘀，健脾疏肝的显著功效，其在抗肝纤维化过程中的作用和机理仍有待深入探讨和挖掘。

[1]黄祎，刘华宝，胡文艳.当代名老中医论治代偿期肝硬化方剂解读(上)[J].中国中医急症，2011，20(11)：1789-1791.

[2]付跃娟.荣肝汤治疗慢性乙型肝炎肝纤维化52例[J].中西医结合肝病杂志，2004，14(1)：56-57.

[3]黎俊民，李敏峰.加味荣肝汤治疗慢性乙型肝炎肝纤维化50例[J].中医杂志，2009，50(9)：815-816.

[4]李光伟，刘崇敏，冯怡，等.扶正化瘀复方多元释药系统的疗效评价[J].中药药理与临床，2015，31(1)：199-202.

[5]沈鼎明.肝纤维化的发生机制[J].中华肝脏病杂志,2000,8(4)：687-689.

[6]Olaso E，Ikeda K，Eng FJ，et al.DDR2 receptor promotes MMPI-mediated proliferation and invasion by hepatic stellate cells [J].Clin Invest，2001，108（9）：1369-1378.

[7]Marcellin P,Gane E,Buti M,et al.Regression of cirrhosis during treatment with tenofovir disoproxil fumarate for chronic hepatitis B：a 5-year open-label follow-up study[J].Lancet,2013,381 (9865)：468-475.

[8]Oze T,Hiramatsu N,Yakushijin T,et al.Post-treatment levels of alpha-fetoprotein predict incidence of hepatocellular carcinoma after interferon therapy[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2014,12(7)：1186-1195.

[9]刘鲁明,李道宽.荣肝汤治疗肝纤维化92例[J].河南中医,2004, 24(5)：30.

[10]夏海珊,陈少茹,钟月春,等.肝纤维化的发病机制和药物治疗现况[J].中国医药导报,2014(18)：162-165.

[11]丁诗正，骆传佳.肝纤维化的中医药治疗概况及其特点[J].中国中医药咨询，2011，23（3）：289-290.

[12]李丽，何清，杨大国，等.扶正化瘀胶囊治疗慢性乙型肝炎肝纤维化有效性和安全性的系统评价[J].中国循证医学杂志，2008，8 (10)：892-897.

[13]王晨晓，罗伟生，郭潇，等.安络化纤丸联合核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的系统评价[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(7)：203-209.

[14]雷娜,郑仕中,陆菌.活血化瘀类中药防治肝纤维化的机制及研究进展[J].中华中医药杂志,2010,25(2)：265-268.

[15]黄煌.论方证相应说及其意义[J].江苏中医药,1998,19(8)：3-5.

（收稿：2016-11-26 修回：2017-02-20）

（责任编辑 刘洪斌 屈振亮）

Preventive Effects of Ronggan Decoction on Dimethylnitrosamin-induced Hepatic Fibrosis in Rats

XIE Lin-qin,ZHU Guan-bao,HUANG Deng
Wenzhou Medical University,Ryan Hospital of TCM,Wenzhou Municipal People’s Hospital,Wenzhou(325035),China

Objective To observe the intervention effects of Ronggan decoction in dimethylnitrosamin( DMN)-induced chronic hepatic fibrosis in rat. Methods A total of 35 Wister male rats were randomly divided into the normal control group and the model group.The model group was used to establish the hepatic fibrosis model with 0.5%DMN by intraperitoneal injection of 2 mL/kg of body mass for 4 weeks,and then by randomly divided the rats into model group and Ronggan group.The two groups were treated with corresponding drug intragastrically every day for 3 weeks.Rats were then sacrificed for sampling at 7 the weekend,and the serum levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)，albumin(Alb),total bilirubin(TBIL), as well as hepatic levels of hydroxyproline(Hyp)were measured.Pathological changes of liver tissue was evaluated by Sirius Red staining and HE staining.Collagen typeⅠ and smooth muscle actin(α-SMA)protein level in liver was determined by western blotting. Results Compared with the normal control group,serum levels of TBIL,ALT,AST were significant increased and Alb were significant descend in the model group(P＜0.05).After the treatment of the Ronggan decoction,serological index of liver function improved significantly.HE staining showed that the model group had a large number of inflammatory cell infiltration,swelling,degeneration and necrosis,and bleeding phenomenon was significant in the liver tissue.Sirius red staining showed that the liver collagen of the model group was significantly hyperplasia,forming a pseudo lobule,collagen area was significantly increased.The Hyp content of the liver tissue of the model group were significantly increased than the normal control group[（1412.42±367.68）μg/g VS（530.20±62.37）μg/g，P＜0.01],and the expression levels of collagen typeⅠand α-SMA has a significant increased.The degree of inflammation and fibrosis in liver tissue were improved in the model group after the drug intervention,and the Hyp content of the liver tissue were decreased obviously[（1092.83±146.19）μg/g].Statistical analysis shows that theliver tissue collagen area of Ronggan group were significantly descend than the model group[(358 810±235 058)×104μm2VS（358 810±235 058）× 104μm2,P＜0.05],and the expression levels of collagen typeⅠ antibodies and α-SMA were decreased obviously.Conclusion Ronggan decoction has better reverse action to liver fibrosis induced by DMN.

Ronggan decoction;liver fibrosis;dimethylnitrosamine;biochemistry indexes;pathologic change

Q95-33;R657.3

A

1007-6948(2017)02-0160-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.02.015

1温州医科大学（温州 325035）

2瑞安市中医院（瑞安 325200）

3温州市人民医院（温州 325000）

谢林钦，E-mail：752581987@qq.com