替米沙坦抑制U937细胞增殖及诱导凋亡*

雷亚梅， 范蕊芳， 许艺川， 赖文兴， 林东军

(中山大学附属第三医院血液科，广东 广州 510630)

替米沙坦抑制U937细胞增殖及诱导凋亡*

雷亚梅， 范蕊芳， 许艺川， 赖文兴， 林东军△

(中山大学附属第三医院血液科，广东 广州 510630)

目的： 探讨替米沙坦对U937细胞株的生长抑制及凋亡诱导作用。方法: 分别以不同浓度的替米沙坦处理人类急性髓系白血病细胞U937；以CCK-8法检测不同浓度替米沙坦对U937细胞的生长抑制作用；以集落形成实验观察不同浓度替米沙坦对U937细胞集落形成能力的影响；以Annexin V-PI双染法及Hoechst 33342染色法检测不同浓度替米沙坦作用前后U937细胞凋亡程度的变化；以流式细胞术检测U937细胞表面抗原CD11b的阳性表达率，瑞氏染色后倒置显微镜进行细胞形态学观察，了解U937细胞的分化情况；以Western blot法检测不同浓度替米沙坦作用U937细胞后凋亡相关蛋白表达量的改变。结果: CCK-8实验结果证实替米沙坦呈时间和剂量依赖性抑制U937细胞的生长；集落形成实验显示低剂量替米沙坦可以完全抑制U937细胞的集落形成能力；Annexin V-PI双染法及Hoechst 33342法结果证实替米沙坦可以诱导U937细胞凋亡；细胞表面抗原流式检测术及瑞氏染色结果证实替米沙坦可以促进部分U937细胞分化；Western blot实验结果证实替米沙坦作用于U937细胞72 h后，促凋亡相关蛋白cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白的水平明显增高。结论: 替米沙坦可以抑制细胞增殖以及诱导U937细胞部分分化，并通过caspase依赖的凋亡途径触发U937细胞凋亡。

替米沙坦； U937细胞； 细胞增殖； 细胞凋亡； 细胞分化

白血病作为一类发病机制尚不完全清楚的异质性恶性克隆性疾病，系幼稚白血病细胞大量增生浸润并影响正常造血功能的造血系统恶性肿瘤，主要表现为贫血、出血、感染等临床症状。近几年来，各种因素导致白血病发病率显著升高，虽然随着化疗药物的不断改进及分子靶向治疗、造血干细胞移植术的逐渐开展，其生存率有所提高, 然而造血干细胞移植术由于配型严格、费用较高、并发症多且风险较大等缺点限制了其广泛开展, 因而积极探索新的抗癌药物对白血病的临床治疗及病人生存质量显得尤为重要。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)属于核激素受体,是一种核转录因子，广泛参与细胞的炎症反应、增殖、凋亡、自噬、分化等生命活动进程[1]。PPARγ在多种细胞中都有丰富的表达，同样在多种人类肿瘤细胞如肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞以及白血病细胞等均有丰富的表达。近几年针对PPARγ及其配体在抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡及分化作用的研究逐渐增多，其抗癌性也越来越得到重视。

替米沙坦作为一种临床上已广泛应用的一线新型降压药物，具有高效性、长效性、低毒性等特点,广泛应用于心血管疾病、糖尿病肾病、高血压肾病的治疗。它是一种特异性血管紧张素Ⅱ 1型受体阻断剂，同时也被证明是一种潜在的选择性PPARγ部分激动剂，主要通过阻断肾素-血管紧张系统和激活PPARγ改善糖尿病合并高血压患者的胰岛素抵抗，用于治疗高血压合并糖尿病导致的肾脏、心脏、血管内皮细胞等功能的损害。 国内研究证明替米沙坦通过抑制内质网应激而减少链脲佐菌素诱导的糖尿病的发生[2]。近年来，多项研究表明替米沙坦对于很多实体瘤如肺腺癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌等肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤效应，该效应主要表现为抑制肿瘤细胞增殖[3-4]、阻滞肿瘤细胞的周期进展[5]、促进肿瘤细胞凋亡[6-7]、诱导细胞自噬等[8]。 最近有文献报道，替米沙坦能诱导成人T淋巴细胞白血病凋亡和自噬[9]。但目前尚无替米沙坦对人白血病U937细胞影响的相关研究报道。本课题主要研究替米沙坦对白血病U937细胞株的作用，观察其对U937细胞增殖、分化的影响，并探讨替米沙坦诱导U937细胞凋亡的机制，为进一步临床应用提供新的思路及理论依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

替米沙坦、鼠抗人CD11b-PE检测盒购于Sigma；胎牛血清、RPMI-1640细胞培养液购于HyClone；CCK-8检测试剂盒购于Dojindo；Annexin V-PI凋亡检测试剂盒购于BD；各种 I 抗及 II 抗购于CST；甲基纤维素为R&D产品；其它生化试剂为国产分析纯产品或进口分装产品。

2 主要方法

2.1 细胞培养 U937细胞株来源于中山大学血液病研究所，使用含有15%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液，于5% CO2、37 °C饱和湿度条件培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验，并根据实验需要分组。

2.2 CCK-8法检测药物对U937细胞活力的影响 取对数期生长的U937细胞接种于96孔细胞培养板上，接种密度为每孔1×104个细胞，分别予不同浓度(5、12.5、25、50、75、100、125和150 μmol/L)替米沙坦作用24 h、48 h和72 h，每浓度点设5个复孔，检测前每孔加10 μL CCK-8溶液，室温避光孵育3 h，后于酶标仪用450 nm 波长测定吸光度(A)。

2.3 甲基纤维素细胞集落形成实验 将空白组和药物处理后的U937细胞培养于甲基纤维素中，置于5% CO2、37 °C饱和湿度条件细胞培养箱中培养7 d，于显微镜下观察U937细胞集落形成情况及计算集落形成率，并随机拍照。

2.4 Annexin V-PI法检测细胞凋亡 收集细胞，离心去上清液，预冷PBS润洗细胞1次(1 000 r/min离心5 min)， 后100 μL 1×binding buffer 重悬细胞，避光环境中依次加入3 μL的Annexin V-FITC和3 μL的PI，微微振荡，室温避光条件下孵育15 min后加入200 μL 1×binding buffer，流式细胞仪检测U937细胞凋亡率。

2.5 细胞凋亡的形态学观察 收集细胞，离心去上清后PBS润洗细胞2次。加入Hoechst 33342(10 mg/L)染液500 μL，混匀后置于37 ℃水浴锅中孵育15 min。然后 PBS洗细胞3次，在荧光显微镜下用紫光激发，观察细胞的细胞核变化，计数凋亡的细胞数，并随机拍照。

2.6 细胞表面分化抗原 CD11b的检测 分别予不同浓度(50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L)替米沙坦作用72 h后的U937细胞按试剂说明要求，分别加入鼠抗人CD11b-PE抗体10 μL，4 °C避光孵育30 min后，流式细胞术检测U937细胞CD11b阳性表达率。

2.7 细胞形态观察 收集不同处理的细胞，将细胞稀释至5×106/L，将细胞滴入甩片机内的载玻片小孔中，以1 800 r/min离心6 min，将细胞甩至载玻片上，风干后用Wright’s染料染色，染A液1 min后，加入B液，混匀，染色5～8 min，在油镜(IX41，Olympus)下观察形态变化。

2.8 Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白 收集细胞后加入含有1 μL PSMF 的RIPA 裂解液100 μL，冰上裂解细胞30 min，4 ℃预冷离心机12 000 r/min 离心15 min，提取上清液即为细胞总蛋白，后BCA法检测蛋白浓度。予12%的SDS-PAGE 凝胶电泳分离上述蛋白，并将其转至PVDF膜上，TBST洗涤1次，丽春红染色后切割目的条带，后置于5%牛血清白蛋白封闭液中封闭1 h，加入抗体孵育4 °C过夜，TBST洗涤3次后加Ⅱ抗室温孵育1 h。ECL(Thermo)显影，凝胶成像系统(Bio-Rad)分析结果。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较分析用t检验或单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 替米沙坦对U937细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，经5 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L、125 μmol/L 和150 μmol/L 终浓度的替米沙坦对U937细胞处理24 h后的细胞活力抑制率分别为(9.08±0.12)%、(14.01±0.13)%、(19.78±0.32)%、(24.06±0.13)%、(32.04±0.26)%、(44.76±0.24)%、(55.34±0.16)%和(60.27±0.38)%，IC50为109.16 μmol/L。替米沙坦对U937细胞活力的抑制作用呈浓度和时间依赖性。随着替米沙坦终浓度的升高和作用时间的延长，对细胞生长的抑制能力增强。

甲基纤维素集落形成实验结果显示，经过7 d培养，未加药组可见集落形成率为90.00%±4.52%，经5 μmol/L和12.5 μmol/L 处理过的细胞集落形成率分别为68.00%±3.20%和32.00%±3.75%，经25 μmol/L 处理后的细胞未见集落形成，表明低剂量的替米沙坦已经完全抑制了U937的集落形成能力(P<0.05)，见图1。

Figure 1.Telmisartan inhibited the proliferation of U937 cells. A: telmisartan inhibited the viability of U937 cells determined by CCK-8 assay; B: the U937 cells treated with telmisartan at various concentrations were incubated in methylcellulose culture for 7 d, and the colony formation capacity was completely suppressed. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1 替米沙坦抑制U937细胞的增殖

2 替米沙坦诱导U937细胞凋亡

Annexin V-PI染色流式细胞术分析结果显示，与实验组相比，50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦作用于U937细胞24 h的凋亡率分别为(7.08±0.18)%、(11.01±0.32)%和(21.98±0.33)%，48 h的凋亡率分别为(11.32±0.24)%、(19.80±1.00)%和(28.98±0.14)%，72 h的凋亡分别为(12.08±0.62)%、(26.54±0.56)%和(52.10±1.60)%。这表明替米沙坦对U937细胞凋亡诱导作用明显，并且U937细胞凋亡率随着替米沙坦浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增加。Hoechst 33342法染色结果表明，50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦处理了72 h的U937细胞可以在显微镜下观察到部分细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染，凋亡率分别为(15.00±0.16)%、(35.00±1.21)%和(58.00±0.32)%，从形态学上验证替米沙坦可以诱导U937细胞凋亡，见图2。

3 替米沙坦对U937细胞分化的影响

用流式细胞术检测替米沙坦诱导U937细胞72 h后CD11b的表达水平，结果表明0 mmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦作用后的CD11b表达率分别为0.313%±0.213%、12.90%±0.27%、16.10%±0.34%和30.80%±0.45%。Wright’s法染色后，于油镜下观察替米沙坦诱导72 h后U937细胞形态学变化，细胞形态图像显示部分U937细胞具有分化的细胞学形态，表现为核质比例升高、核仁减少或消失、核质疏松和和分叶增多，见图3。

4 替米沙坦对cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白表达量的影响

Western blot 实验结果显示，U937细胞经过终浓度分别为50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 的替米沙坦处理72 h后，与对照组相比，caspase-3逐渐被活化，出现17 kD与19 kD活化片段，PARP 被活化的caspase-3裂解出现89 kD的剪切片段, caspase-3活化及PARP裂解的强度随药物浓度的增加而增强，表明替米沙坦通过caspase途径诱导U937细胞凋亡，见图4。

讨 论

PPAR属于核激素受体超家族的成员，是一种核转录因子[10]，共有 α、β和γ 3 个亚型，在多种细胞中均有丰富的表达，与细胞生长、增殖、分化、纤维化、脂类代谢、炎症反应及免疫反应等密切相关[11]。PPARγ在多种人类肿瘤细胞如肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌以及白血病细胞等均有丰富的表达，随着针对PPARγ及其配体在抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用的研究增多[12-14]，其抗癌性也越来越得到重视。多项研究证明PPARγ及其配体在多种肿瘤中发挥抗癌作用，如结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝癌、白血病等[15-16]。最新研究表明，替米沙坦作为一种潜在的选择性PPARγ部分激动剂，激活受体的效应可以达到完全激动剂匹格列酮和罗格列酮最高水平的25%～30%[17]。Li等[18]研究证明，替米沙坦可以通过上调PPARγ抑制肺腺癌A594细胞增殖。Pu等[19]证明替米沙坦通过上调PPARγ能诱导人卵巢癌细胞凋亡。

细胞凋亡受阻在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。目前认为细胞外的凋亡诱导途径分为caspase依赖和非caspase依赖的凋亡途径[20]。Caspase是具有ICE/CED-3结构特征的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作用。作为目前发现的caspase成员中与CED-3同源性最高者，caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末执行因子，它的激活可使细胞发生不可逆的凋亡[21]。Caspase-3与细胞膜空泡形成、核膜破裂、染色质聚集和边聚及DNA断裂等以及一些生化改变关系密切，在细胞凋亡启动时，作用底物PARP被活化的caspase-3剪切，激活DNA内切酶，诱导细胞凋亡[22]。国外研究证明替米沙坦可以通过上调PPARγ显著抑制肾癌细胞的生长并通过活化caspase-3诱导细胞凋亡[23]。本研究发现替米沙坦可以明显抑制U937细胞增殖，并能诱导其凋亡，这种作用呈时间和剂量依赖性。Western blot结果显示cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白水平随着替米沙坦作用浓度的增加逐渐增加，推测替米沙坦活化凋亡蛋白酶caspase-3，活化的caspase-3进一步剪切PARP，通过caspase依赖的凋亡途径诱导U937细胞凋亡，这是替米沙坦抗肿瘤可能机制之一。细胞分化障碍与恶性肿瘤的发生关系密切，研究证明许多药物可以促进白血病细胞分化[24]。本课题通过对替米沙坦作用后U937细胞CD11b阳性表达率的测定及细胞形态学观察，显示替米沙坦一定程度上可以促进U937细胞分化。研究证明替米沙坦可以促进血管内皮祖细胞分化[25]，但目前国内外尚无替米沙坦对肿瘤细胞分化作用的研究报道。

本实验初步证实替米沙坦可以抑制U937细胞增殖，促进其分化并诱导其凋亡，主要是通过活化caspase途径来实现的。PPARγ在恶性血液肿瘤细胞中广泛表达，PPARγ配体可以有效诱导白血病细胞凋亡和促进分化[26]。因此，替米沙坦对U937的增殖抑制作用可能与PPARγ的部分激活有关，但其具体机制需要进一步研究证明。

Figure 2.Telmisartan induced apoptosis in the U937 cells. A: the U937 cells treated with telmisartan were stained with Annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis; B: the U937 treated with different concentrations of telmisartan for 72 h were stained with Hoechst 33342 and observed under a fluorescence microscope (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图2 替米沙坦诱导U937细胞凋亡

Figure 3.Telmisartan induced differentiation in the U937 cells. A: the U937 treated with different concentrations of telmisartan for 72 h were subjected to flow cytometry analysis to determine the expression of CD11b; B: the images of Wright’s staining of the cells were observed under microscope (×1 000). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图3 替米沙坦诱导U937细胞分化

Figure 4.The effect of telmisartan on the protein levels of the apoptosis-related proteins in the U937 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图4 替米沙坦对U937细胞内凋亡相关蛋白表达的影响

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Telmisartan inhibits proliferation and induces apoptosis in U937 cells

LEI Ya-mei, FAN Rui-fang, XU Yi-chuan, LAI Wen-xing, LIN Dong-jun

(DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lindongjun0168@163.com)

AIM: To demonstrate the effects of telmisartan on the proliferation and apoptosis of U937 cells. METHODS: The proliferation ability of the U937 cells was assessed by CCK-8 assay and colony formation test with methylcellulose. The CD11b expression rate of the U937 cells was identified by flow cytometry. The apoptotic rate was analyzed by flow cytometry with Annexin V-PI double staining and Hoechst 33342 staining. The protein levels of cleaved PARP and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. RESULTS: The results of CCK-8 assay confirmed that the viability of U937 cells was inhibited by telmisartan. The colony formation capacity of U937 cells was also significantly inhibited by telmisartan. The differentiation of U937 cells was induced by telmisartan with the expression of CD11b. The results of flow cytometry analysis with Annexin V-PI double staining and Hoechst 33342 staining identified that the apoptosis of U937 cells was induced by telmisartan in dose-dependent and time-dependent manners with the up-regulation of cleaved PARP and cleaved caspase-3 proteins. CONCLUSION: Telmisartan inhibits the proliferation and induces the differentiation of U937 cells. Telmisartan also induces the apoptosis of U937 cells through the caspase pathway.

Telmisartan; U937 cells; Cell proliferation; Apoptosis; Cell differentiation

1000- 4718(2017)04- 0669- 07

2016- 11- 17

2017- 03- 03

广东省科技计划项目(No. 2013B021800079)

R965； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.015

△通讯作者 Tel: 020-85252777; E-mail: lindongjun0168@163.com