小鼠海马糖原合成酶激酶3β 过表达对小补心汤总黄酮抗抑郁和抗焦虑作用的影响

叶洪涛，薛瑞，许方敏，丁振春，邓云，张有志

（1.安徽理工大学医学院，安徽淮南232000；2.军事医学科学院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京100850）

·论著·

小鼠海马糖原合成酶激酶3β 过表达对小补心汤总黄酮抗抑郁和抗焦虑作用的影响

叶洪涛1，2，薛瑞2，许方敏2，丁振春2，邓云1，张有志2

（1.安徽理工大学医学院，安徽淮南232000；2.军事医学科学院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京100850）

目的评价小鼠海马糖原合成酶激酶3β（GSK3β）过表达对小补心汤总黄酮（XBXT-2）抗抑郁和抗焦虑作用的影响。方法小鼠海马立体定位微注射包装有GSK3β（S 9A）突变型基因的腺相关病毒（AAV）制备小鼠GSK3β过表达模型，3周后采用Western蛋白印迹法检测GSK3β和磷酸化GSK3β（S9）〔p-GSK3β（S9）〕含量，采用开场实验检测小鼠自发活动。而后将空载体AAV组和GSK3β过表达组小鼠各自分为给药组和溶剂组，分别ig给予XBXT-2 100 mg·kg-1或同体积蒸馏水，每天1次，分别于给药14和16 d采用悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠抑郁样行为，18和20 d采用高架十字迷宫实验和爬梯实验检测小鼠焦虑样行为。结果Western蛋白印迹法检测结果显示，与AAV组相比，GSK3β过表达组小鼠海马GSK3β含量显著升高（P＜0.01），p-GSK3β（S9）含量无显著性差异。在开场实验中，GSK3β过表达组与AAV组间小鼠跨格次数和站立次数无显著差异。在小鼠悬尾和强迫游泳实验中，AAV+XBXT-2组与AAV组比较，小鼠不动时间显著缩短（P＜0.05，P＜0.01）；GSK3β过表达+XBXT-2组与GSK3β过表达组比较，小鼠不动时间无明显差异。在高架十字迷宫实验中，与AAV组比较，AAV+XBXT-2组小鼠进入开臂次数百分比和开臂停留时间百分比显著增加（P＜0.01，P＜0.05）；与GSK3β过表达组比较，GSK3β过表达+XBXT-2组小鼠上述行为指标无明显改变。在爬梯实验中，AAV+XBXT-2组比AAV组小鼠爬梯站立次数显著减少（P＜0.05）；GSK3β过表达+XBXT-2组与GSK3β过表达组比较，小鼠站立次数无明显差异。结论海马脑区GSK3β过表达可取消XBXT-2在小鼠悬尾和强迫游泳实验中的抗抑郁作用及在高架十字迷宫实验和爬梯实验中的抗焦虑作用。

小补心汤；总黄酮；抑郁；焦虑；糖原合成酶激酶3β；腺相关病毒

抑郁症和焦虑症属于中医情志病范畴，中医药对其认识和治疗有着悠久的历史。近年来，越来越多的临床与基础研究表明，中药对抑郁症和焦虑症有很好的治疗作用［1-2］。小补心汤（Xiaobuxin Tang，XBXT）出自南北朝时期陶弘景所著的敦煌莫高窟遗书《辅行决脏腑用药法要》，由旋覆花、代赭石、淡竹叶和淡豆豉4味中药组成。本课题组前期在国内首次发现，XBXT及其总黄酮提取物（XBXT-2）在多种抑郁模型上具有良好的抗抑郁活性，其作用机制与增强脑组织5-羟色胺（5-hydroxytrypta⁃mine，5-HT）神经系统的功能、增强神经营养、促进神经元再生和抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进等作用有关［3-6］。

糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）是一种在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在中枢神经系统分布广泛，分为α和β亚型。GSK3是为数不多的磷酸化后功能失活的激酶［7］，GSK3α和GSK3β磷酸化位点分别为N端的21位和9位丝氨酸位点。GSK3不仅可以调节糖原合成酶的功能，还作用于众多的信号蛋白、结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡［8］。20世纪90年代发现，锂盐的抗抑郁作用与抑制GSK3β的活性密切相关，从而开启了GSK3β与精神疾病相关性的研究。近年来越来越多的研究表明，GSK3β在抑郁症和焦虑症的发生及治疗中发挥重要的作用［9-10］。本课题组前期发现，XBTX-2能够增加慢性应激大鼠海马磷酸化GSK3β的水平。为此，本研究采用以腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）为载体的基因转染技术，通过微注射在海马部位导入GSK3β突变型基因〔GSK3β（S9A），即N端9位丝氨酸突变为丙氨酸〕，该基因表达的突变型GSK3β在功能上与内源性GSK3β一致，但无法磷酸化，造成GSK3β功能在海马部位持续激活，进而探讨GSK3β是否是XBXT-2发挥抗抑郁和抗焦虑作用的关键靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性ICR小鼠，SPF级，体质量18～20 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXX（京）2016-0002。小鼠饲养于军事医学科学院毒物药物研究所动物行为实验中心，每笼6只群养，温度22～24℃，光照时间7∶00-19∶00，自由进食、饮水，手术前适应饲养6 d。

1.2 药品、试剂和仪器

XBXT-2由军事医学科学院毒物药物研究所植物化学研究室提供，制备方法参照文献［11-12］；含小鼠源GSK3β（S9A）突变型基因的AAV〔AAV-GSK 3β（S9A）〕以及AAV空载体由厦门安提海拉生物科技有限公司提供。AAV-GSK3β（S9A）是通过PCR钓取小鼠源GSK3β基因，构建AAV载体pAAV-CMV-mGSK3β，再将其突变成S9A，最后转染AAV293细胞包装9型AAV，不含有GSK3β基因的空载体AAV作为阴性对照。病毒滴度为1.88×1017vp·L-1和1.67×1017vp·L-1。AAV自带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标签。

兔抗GSK3β单克隆抗体和兔抗磷酸化GSK3β（S9）〔p-GSK3β（S9）〕单克隆抗体购自于美国Cell Signaling Technology公司；小鼠抗β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）均购自于北京中杉金桥公司；RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均购自于普利莱公司。立体定位仪和电动磨钻购自于中国瑞沃德公司；微量注射泵购自于美国Hamilton公司；微注射控速泵购自于美国World Precision Instruments公司；蛋白电泳仪器购自于美国BioRad公司；荧光成像仪购自于美国LI-COR Biotechnology公司；冰冻切片机购自于德国Leica公司。

1.3 海马齿状回立体定位微注射

小鼠适应饲养6 d，体质量达到26～27 g时进行海马齿状回立体定位手术。小鼠经水合氯醛（400 mg·kg-1，ip）麻醉后固定于脑立体定位仪，消毒并切开头皮暴露颅骨，确定海马注射位置（前囟后1.7 mm，左右旁开各1.8 mm，深度2.0 mm）。双侧海马微量注射，每侧注射体积为1 μL，注射速率为0.2 μL·min-1，留针5 min。术后将头皮缝合。

1.4 荧光显微镜观测病毒感染部位

为了确定病毒感染位置，预实验对6只小鼠海马微注射AAV空载体，3周后用水合氯醛（400 mg·kg-1，ip）麻醉，用4%多聚甲醛溶液进行心脏灌流，取脑、梯度脱水、制作冰冻切片，切片厚度为30 μm，封片后立即于荧光显微镜下观察绿色荧光确认病毒感染部位。

1.5 Western蛋白质印迹法检测海马GSK3β和p-GSK3β（S9）含量

为了确定基因转染后目的蛋白表达情况，预实验对8只小鼠海马微注射AAV空载体或AAVGSK3β（S9A），3周后处死，冰上分离双侧海马，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，超声破碎1 min，冰上静置30 min后，12 000×g，4℃离心30 min，取上清液，BCA法测定蛋白质浓度。上清液加入等体积的2×上样缓冲液，放入沸水中变性5～10 min。将40 μg蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及凝胶湿法转印至PVDF膜上，经5%牛血清白蛋白室温封闭2 h。按照说明书，加入一抗（1∶1000稀释）4℃孵育过夜，而后加入二抗（1∶3000稀释）室温孵育1 h，放入显影仪显影，采用Gelpro软件分析蛋白条带，以GSK3β和p-GSK3β（S9）分别与内参蛋白β肌动蛋白的积分吸光度比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.6 实验流程、分组与给药

ICR小鼠48只，按体质量均衡随机分为2组，分别于海马齿状回立体定位微注射AAV空载体（AAV组）或AAV-GSK3β（S9A）（GSK3β过表达组）。术后恢复饲养3周，进行开场实验。而后将2组小鼠进一步随机分成对照组与给药组，分别ig给予XBXT-2 100 mg·kg-1或等体积蒸馏水，每天1次，于给药14，16，18和20 d进行悬尾、强迫游泳、高架十字迷宫和爬梯实验。

1.7 开场实验

微注射术后恢复饲养3周后进行开场实验。开场箱为36 cm×30 cm×30 cm的透明有机玻璃箱，底面划线分割成等大的9个方格，将小鼠头朝同一方向放入开场箱中心，立即开始观察，记录小鼠10 min内的跨格数和站立次数（以四肢均进入同一方格判定为跨格，两前肢同时离开地面判定为站立）。

1.8 悬尾实验

给药14 d参照Steru等［13］建立的方法进行悬尾实验。各组小鼠ig给药60 min后，用胶布黏住鼠尾距尾尖2 cm处，用夹子夹住胶布，将小鼠倒悬在黑色悬尾箱（25 cm×25 cm×35 cm）中，头部距箱底约5 cm，立即开始观察6 min，记录后4 min内小鼠的不动时间（不动标准为小鼠停止挣扎，身体呈倒悬静止状态）。

1.9 强迫游泳实验

给药16 d参照Porsolt等［14］建立的方法进行强迫游泳实验。各组小鼠ig给药60 min后，将小鼠放入高20 cm、直径12 cm的圆柱形玻璃游泳缸中，水深10 cm，水温25℃。立即开始观察6 min，记录后4 min内小鼠的不动时间（不动标准为身体呈漂浮状态，或仅四肢轻微运动以保证头部浮于水面）。

1.10 高架十字迷宫实验

给药18 d参照Lister等［15］改良的实验方法进行高架十字迷宫实验。高架十字迷宫为黑色有机玻璃装置，由两条开臂和两条闭臂组成，臂宽6 cm，长50 cm，呈十字型连通结构。闭臂3个侧面封闭，顶部开放，开臂完全开放，无遮挡，交叉区域为中央区。整个装置架高，距地面45 cm。各组小鼠ig给药60 min后，头朝开臂方向放入中央区，立即开始观察5 min，记录小鼠分别进入开臂和闭臂的次数及停留时间（入臂行为以四肢均进入为准）。统计指标为入臂总时间（即进入开、闭臂时间之和）、入臂总次数（即进入开、闭臂次数之和）、开臂停留时间百分比〔开臂停留时间（%）=开臂停留时间/入臂总时间× 100%〕和入开臂次数百分比〔入开臂次数（%）=进入开臂次数/入臂总次数×100%〕。

1.11 爬梯实验

给药20 d参照Simiand等［16］改良的实验方法进行爬梯实验。爬梯实验装置为一透明有机玻璃箱，内有5级高2.5 cm、宽10 cm的楼梯，楼梯侧壁的高度一致。各组小鼠ig给药60 min后，将小鼠背朝楼梯放在实验箱底部，立即开始观察5 min，记录小鼠爬梯数（以四肢都爬上楼梯为准）和站立次数。

1.12 统计学分析

实验结果数据用x±s表示，使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。蛋白含量检测和自发活动计数结果采用t检验，其余数据均采用双因素方差分析（two-way ANOVA），组间比较采用Tukey检验，以P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 小鼠海马微注射AAV感染部位及GSK3β 蛋白表达

微注射AAV小鼠AAV感染部位如（图1）所示，在荧光显微镜下，小鼠海马齿状回立体定位微注射3周后，整个海马区可见GFP表达，而海马外脑区未见绿色荧光。Western蛋白印迹法检测结果（图2）所示，与AAV组相比，GSK3β过表达组小鼠海马GSK3β含量显著升高（P＜0.01），而p-GSK3β（S9）含量无显著性差异。提示AAV携带的GSK3β（S9A）突变型基因在海马部位成功过表达，且外源性GSK3β无法被磷酸化，GSK3β功能被持续激活。

Fig.1 Adeno-associated virus（AAV）transfection area in hippocampus.Mice were microinfused with AAV empty vec⁃tor and sacrificed 3 weeks later.Specific expression of green fluorescent protein（GFP）was observed under fluorescence microscopy.

Fig.2 Expression of glycogen synthase kinase 3β（GSK3β ）and phospho-GSK3β （S9）in hippocampus tissue of mice microinfused with AAV-GSK3β（S9A）by Western blotting.The mice were microinfused with AAVGSK3β（S9A）or AAV empty vector and sacrificed 3 weeks later. B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with AAV group.

2.2小鼠海马GSK3β 过表达对自发活动的影响

开场实验结果显示，GSK3β过表达组与AAV组小鼠跨格次数和站立次数均无显著差异（表1），提示GSK3β过表达对中枢神经系统不产生兴奋或抑制作用。

Tab.1 Effect of GSK3β over expression on locomotor activity in open field test in mice

2.3 小鼠海马GSK3β 过表达对XBXT-2抗抑郁活性的影响

在悬尾实验中，GSK3β过表达组与AAV组间小鼠悬尾不动时间无明显差异；AAV+XBXT-2组与AAV组比较，不动时间明显缩短（P＜0.05）；GSK3β过表达+XBXT-2组与GSK3β过表达组比较，不动时间无显著差异（表2）。

Tab.2 Effect of GSK3β over-expression in hippocampus on immobility time in tail suspension test of XBXT-2 in mice

在强迫游泳实验中，GSK3β过表达组与AAV组小鼠游泳不动时间无明显差异；AAV+XBXT-2组与AAV组比较，不动时间明显缩短（P＜0.05）；GSK3β过表达+XBXT-2组与GSK3β过表达组比较，不动时间无明显变化；而GSK3β过表达+ XBXT-2组与AAV+XBXT-2组比较，小鼠游泳不动时间显著延长（P＜0.05）（表3）。

Tab.3 Effect of GSK3β over expression in hippocampus on immobility time in forced swimming test of XBXT-2 in mice

2.4 小鼠海马GSK3β 过表达对XBXT-2抗焦虑活性的影响

在高架十字迷宫实验中，与AAV组比较，GSK3β过表达组小鼠进入开臂次数百分比显著减少（P＜0.05），AAV+XBXT-2组小鼠进入开臂次数百分比（P＜0.01）和开臂停留时间百分比（P＜0.05）均显著增加；与GSK3β过表达组比较，GSK3β过表达+XBXT-2组进入开臂次数百分比和开臂停留时间百分比无显著差异；与AAV+XBXT-2组比较，GSK3β过表达+XBXT-2组小鼠进入开臂次数百分比（P＜0.01）和开臂停留时间百分比（P＜0.05）均显著减少。此外，各组间入臂总时间和总次数均无显著差异（表4）。

XBXT-2在爬梯实验中，与AAV组比较，AAV+ XBXT-2组小鼠站立次数显著减少（P＜0.05）；与AAV+XBXT-2组比较，GSK3β过表达+XBXT-2组小鼠站立次数显著增加（P＜0.05）；而AAV组与GSK3β过表达组之间，及GSK3β过表达组与GSK3β过表达+XBXT-2组之间，小鼠站立次数均无显著差异。此外，各组间爬梯次数均无显著差异（表5）。

Tab.4 Effect of GSK3β over expression in hippocampus on exploratory behavior of XBXT-2 in elevated plus maze test in mice

Tab.5 Effect of GSK3β over expression in hippocampus on exploratory behavior in stair case test of XBXT-2 in mice

3 讨论

近年来越来越多的研究表明，GSK3β在抑郁症和焦虑症的发生和治疗中发挥着重要作用，主要证据包括：重度抑郁症死亡患者大脑皮质GSK3活性升高［17］；通过转基因方法阻断小鼠GSK3β的抑制性磷酸化过程可产生焦虑样表现［18］；GSK3β持续激活（KI小鼠）可取消氟西汀的抗抑郁作用和促神经元再生作用［19-20］；选择性GSK3β抑制剂可在动物模型上产生抗抑郁样作用［21］；等等。

转基因动物是研究GSK3β在精神疾病的发生与治疗中的常用手段，然而需要在胚胎期对目的基因进行操作，可能存在胚胎死亡或代偿性功能改变等缺陷［22］。与转基因动物相比，病毒载体介导的基因转染具有以下优势：①可实现定位注射，从而研究特定脑区目的基因改变的影响；②实验对象为成年动物，避免了发育过程中代偿机制的影响；③实验周期和成本较低。常用病毒载体包括慢病毒、AAV和腺病毒。本研究使用的AAV是一种单链DNA病毒，病毒基因组游离于宿主基因组外，具有长期表达的潜能，与慢病毒相比，表达丰度高，弥散性更好，作用时间更长，免疫原性低［23］。

本研究采用小鼠悬尾和小鼠强迫游泳模型，以及小鼠高架十字迷宫和小鼠爬梯模型，分别评价AAV介导的海马GSK3β（S9A）过表达（表现为9位丝氨酸无法磷酸化，导致GSK3β功能持续激活）对抑郁样行为和焦虑样行为的影响，以及GSK3β是否为XBXT-2发挥抗抑郁作用和抗焦虑作用的关键环节。小鼠悬尾和小鼠强迫游泳是经典的抑郁样行为评价模型，抗抑郁药物能缩短小鼠悬尾和游泳的不动时间。高架十字迷宫实验是利用小鼠对新奇环境的探究习性和对高悬开臂的恐惧形成矛盾冲突而建立的焦虑样行为评价模型，抗焦虑药物可增加小鼠对开臂的探究行为，使进入开臂次数百分比和开臂停留时间百分比增加［24］。爬梯实验是利用啮齿动物进入新奇环境时会表现出紧张不安、探究行为增加的行为特性而建立的焦虑样行为评价模型，抗焦虑药物可使小鼠站立次数减少，而不影响爬梯次数（反映动物的运动活性）［16］。本研究发现，在上述行为模型上，XBXT-2在AAV组小鼠上具有良好的抗抑郁和抗焦虑作用，然而在GSK3β过表达组小鼠上，该行为效应消失，表明GSK3β过表达可取消XBXT-2的抗抑郁和抗焦虑作用。本研究还发现，海马GSK3β过表达可使小鼠在高架十字迷宫实验中产生焦虑样行为表现，提示海马GSK3β功能持续激活可能参与焦虑症的发生。本研究中，在经典的悬尾实验和强迫游泳实验上未观察到GSK3β过表达导致小鼠出现抑郁样行为表现，与文献［20］报道一致，但也有研究显示，GSK3β失抑制会增加抑郁的易感性［19，25］，而GSK3β失抑制是否增加应激的易感性进而参与抑郁症的发生还需要进一步实验证实。

［1］Liu L，Liu C，Wang Y，Wang P，Li Y，Li B.Herbal medicine for anxiety，depression and insomnia［J］.Curr Neuropharmacol，2015，13（4）：481-493.

［2］McIntyre E，Saliba AJ，Wiener KK，Sarris J.Herbal medicine use behaviour in Australian adults who experience anxiety：a descriptive study［J］.BMC Complement Altern Med，2016，16：60.

［3］Zhang YZ，Yu NJ，Yuan L，An L，Zhao YM，Xiao WB，et al.Antidepressant effect of total flavo⁃noids extracted from Xiao Buxin Tang in forced swimming tests and learned helplessness in rats and mice［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中国药理学与毒理学杂志），2008，22（1）：1-8.

［4］An L，Zhang YZ，Yu NJ，Liu XM，Zhao N，Yuan L，et al.The total flavonoids extracted from Xiao Buxin-Tang up-regulate the decreased hippocampal neu⁃rogenesis and neurotrophic molecules expression in chronically stressed rats［J］.Prog Neuropsycho⁃pharmacol Biol Psychiatry，2008，32（6）：1484-1490.

［5］An L，Zhang YZ，Yu NJ，Liu XM，Zhao N，Yuan L，et al.Role for serotonin in the antidepressant-like effect of a flavonoid extract of Xiao Buxin-Tang［J］. Pharmacol Biochem Behav，2008，89（4）：572-580.

［6］Zhang LM，Wang HL，Zhao N，Chen HX，Li YF，Zhang YZ.Involvement of nitric oxide（NO）signaling pathway in the antidepressant action of the total flavonoids extracted from Xiao Buxin-Tang［J］. Neurosci Lett，2014，575：31-36.

［7］Li X，Jope RS.Is glycogen synthase kinase-3 a central modulator in mood regulation？［J］.Neuro⁃psychopharmacology，2010，35（11）：2143-2154.

［8］Ali A，Hoeflich KP，Woodgett JR.Glycogen syn⁃thase kinase-3：properties，functions，and regula⁃tion［J］.Chem Rev，2001，101（8）：2527-2540.

［9］Gould TD，Manji HK.The Wnt signaling pathway in bipolar disorder［J］.Neuroscientist，2002，8（5）：497-511.

［10］DaRocha-Souto B1，Coma M，Pérez-Nievas BG，Scotton TC，Siao M，Sánchez-Ferrer P，et al.Acti⁃vation of glycogen synthase kinase-3 beta medi⁃ates β-amyloid induced neuritic damage in Alzheimer′s disease［J］.Neurobiol Dis，2012，45（1）：425-437.

［11］AN L，Zhang YZ，Yu NJ，Chen HX，Zhao YM，Xiao WB，et al.Antidepressant effect of total flavo⁃noids extracted from Xiaobuxin-Tang on chronical⁃ly mildly stressed model rats［J］.Chin J Pharma⁃col Toxicol（中国药理学与毒理学杂志），2008，22（2）：102-107.

［12］Chen L，Xue R，Yi NJ，Wang L，Hu XX，Qiu ZK，et al.Total flavonoids extracted from Xiao Buxintang on hyperactivity of hypothalamic-pituitary-ad⁃renal axis in mouse learned helplessness model［J］.Chin Pharmacol Bull（中国药理学通报），2015，31（6）：815-821.

［13］Steru L，Chermat R，Thierry B，Simon P.The tail suspension test：a new method for screening anti⁃depressants in mice［J］.Psychopharmacology（Berl），1985，85（3）：367-370.

［14］Porsolt RD，Bertin A，Jalfre M.Behavioral despair in mice：a primary screening test for antidepressants［J］.Arch Int Pharmacodyn Ther，1977，229（2）：327-336.

［15］Lister RG.The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse［J］.Psychopharmacology（Berl），1987，92（2）：180-185.

［16］Simiand J，Keane PE，Morre M.The staircase test in mice：a simple and efficient procedure for primary screening of anxiolytic agents［J］.Psychopharma⁃ cology（Berl），1984，84（1）：48-53.

［17］Karege F，Perroud N，Burkhardt S，Schwald M，Ballmann E，La Harpe R，et al.Alteration in kinase activity but not in protein levels of protein kinase B and glycogen synthase kinase-3beta in ventral prefrontal cortex of depressed suicide victims［J］.Biol Psychiatry，2007，61（2）：240-245.

［18］Polter A，Beurel E，Yang S，Garner R，Song L，Miller CA，et al.Deficiency in the inhibitory serinephosphorylation of glycogen synthase kinase-3 increases sensitivity to mood disturbances［J］. Neuropsychopharmacology，2010，35（8）：1761-1774.

［19］Polter AM，Yang S，Jope RS，Li X.Functional signifi⁃cance of glycogen synthase kinase-3 regulation by serotonin［J］.Cell Signal，2012，24（1）：265-271.

［20］Eom TY，Jope RS.Blocked inhibitory serine-phos⁃phorylation of glycogen synthase kinase-3alpha/beta impairs in vivo neural precursor cell proliferation［J］.Biol Psychiatry，2009，66（5）：494-502.

［21］Kaidanovich-Beilin O，Milman A，Weizman A，Pick CG，Eldar-Finkelman H.Rapid antidepressivelike activity of specific glycogen synthase kinase-3 inhibitor and its effect on beta-catenin in mouse hippocampus［J］.Biol Psychiatry，2004，55（8）：781-784.

［22］Chew B，Ryu JR，Ng T，Ma D，Dasgupta A，Neo SH，et al.Lentiviral silencing of GSK3β in adult dentate gyrus impairs contextual fear memory and synaptic plasticity［J］.Front Behav Neurosci，2015，9：158.

［23］Hastie E，Samulski RJ.Recombinant adeno-asso⁃ciated virus vectors in the treatment of rare diseases［J］. Expert Opin Orphan Drugs，2015，3（6）：675-689.

［24］Qiu ZK，Zhang LM，Zhao N，Chen HX，Zhang YZ，Liu YQ，et al.Repeated administration of AC-5216，a ligand for the 18 kDa translocator protein，im⁃proves behavioral deficits in a mouse model of post-traumatic stress disorder［J］.Prog Neuropsy⁃chopharmacol Biol Psychiatry，2013，45：40-46.

［25］Pardo M，Abrial E，Jope RS，Beurel E.GSK3β Isoform-selective regulation of depression，memory and hippocampal cell proliferation［J］.Genes Brain Behav，2016，15（3）：348-355.

Effect of glycogen synthase kinase 3β overexpression in hippocampus on antidepressant and anxiolytic activity of total flavoids from Xiaobuxin Tang in mice

YE Hong-tao1,2,XUE Rui2,XU Fang-min2,DING Zhen-chun2,DENG Yun1,ZHANG You-zhi2
(1.School of Medicine,Anhui University of Science and Technology,Huainan 232000,China;2.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures,Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China)

OBJECTIVETo study the influence of glycogen synthase kinase3β(GSK3β)over expres⁃sion in the hippocampus on the antidepressant and anxiolytic effects of total flavoids from Xiaobuxin Tang(XBXT-2).METHODSAdeno-associated virus containing GSK3β(S9A)mutation was microinjected into the hippocampus.After three weeks of recovery,GSK3β and p-GSK3β were detected by Western blotting,and open field test(OFT)was used to evaluate the locomotor activity.Then,AAV group and GSK3β over expression group were divided into administration group and solvent group,respectively. XBXT-2(100 mg·kg-1)and solvent were ig administered chronically.After 14 d and 16 d of administra⁃tion,the tail suspension test(TST)and forced swimming test(FST)were used to investigate the influence of GSK3β over expression on the antidepressant effect of XBXT-2,respectively.After 18 d and 20 d of administration,the elevated plus maze test(EPMT)and staircase test(ST)were used to investigate the influence of GSK3β over expression on the anxiolytic effects of XBXT-2,respectively.RESULTSWestern blotting analysis showed that the protein level of GSK3β increased significantly in GSK3β over expression group(P＜0.01)compared with AAV group,but there was no significant difference in p-GSK3β.In OFT,the number of crossings and rearings showed no difference between AAV group and GSK3β over expression group.The results of TST and FST showed that compared with AAV group,the immobility time was significantly reduced in AAV+XBXT-2 group(P＜0.05,P＜0.01),but compared with GSK3β over expression group,the immobility time showed no difference in GSK3β over expression+ XBXT-2 group.In EPMT,compared with AAV group,the percentage of entrances and time into open arms in AAV+XBXT-2 group was significantly increased(P＜0.01,P＜0.05),but compared with GSK3β over expression group,these indexes showed no difference in GSK3β over expression+XBXT-2 group. In ST,compared with AAV group,the number of rearings was significantly reduced in AAV+XBXT-2 group(P＜0.05),but there was no difference between GSK3β over expression+XBXT-2 group and GSK3β over expression group.CONCLUSIONGSK3β over expression in the hippocampus can reverse the antidepressant effects of XBXT-2 in the TST and FST,and the anxiolytic effects in the EPM and ST.

Xiaobuxin Tang;total flavoids;depression;anxiety;glycogen synthase kinase 3β;adenoassociated virus

DENG Yun,E-mail:yunfree196@yeah.net,Tel：13866306502;ZHANG You-zhi,E-mail：13901363887@163.com,Tel：（010）66874620

R964

：A

：1000-3002-（2017）03-0224-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.004

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81274117);and National Nat⁃ural Science Foundation of China(81302761)

2016-12-06接受日期：2017-01-23）

（本文编辑：赵楠）

国家自然科学基金（81274117）；国家自然科学基金（81302761）

叶洪涛，男，硕士研究生，主要从事精神药理学研究，Tel:（010）66931619，E-mail：yehongtao12345@163.com；邓云，女，教授，主要从事中药药理学研究；张有志，男，研究员，主要从事精神药理学研究。

邓云，E-mail：yunfree196@yeah.net，Tel：1386-6306502；张有志，E-mail：13901363887@163.com，Tel：（010）66874620