性激素结合球蛋白、胰岛素信号转导蛋白和葡萄糖转运蛋白在妊娠期糖尿病胎盘组织中的表达及相关性分析

张宝，孙磊，郑阳，姜洁璇，金镇

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

·论著·

性激素结合球蛋白、胰岛素信号转导蛋白和葡萄糖转运蛋白在妊娠期糖尿病胎盘组织中的表达及相关性分析

张宝，孙磊，郑阳，姜洁璇，金镇

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

目的 研究妊娠期糖尿病（GDM）孕妇胎盘组织中性激素结合球蛋白（SHBG）、胰岛素信号转导蛋白及葡萄糖转运蛋白表达，探讨其在GDM发病过程中的作用。方法 收集足月妊娠且非肥胖（BMI＜25 kg/m2）GDM孕妇（GDM组）和同期糖代谢正常（正常组）孕妇胎盘组织各10例，应用Western blotting、实时PCR方法检测2组胎盘组织中SHBG和胰岛素信号转导蛋白（IRS⁃1、ISR⁃2、PI3K p85α）和葡萄糖转运蛋白（GLUT⁃1、GLUT⁃3、GLUT⁃4）的表达，各指标进行直线回归依存关系分析。结果 与正常组比较，GDM组胎盘组织中SHBGmRNA、蛋白表达降低（P＜0.05）；IRS⁃1蛋白、IRS⁃2mRNA表达降低（P＜0.05）；PI3K p85α和GLUT⁃1蛋白及其mRNA表达无统计学差异（P＞0.05）；GLUT⁃3蛋白，GLUT⁃4mRNA、蛋白表达降低（P＜0.05）。直线回归分析结果显示SHBGmRNA与IRS⁃2mRNA、PI3K p85αmRNA、GLUT⁃4mRNA的表达呈正相关（均P＜0.05）；IRS⁃2mRNA和GLUT⁃4mRNA的表达呈正相关（P＜0.01）；IRS⁃1mRNA和PI3K p85αmRNA、GLUT⁃3mRNA的表达呈负相关（P＜0.05）；IRS⁃2mRNA和GLUT⁃1mRNA的表达正相关（P＜0.01）。结论 GDM孕妇胎盘中胰岛素信号转导和葡萄糖转运蛋白存在异常，SHBG可能参与胰岛素信号通路的调节，GDM时胎盘滋养细胞合成和分泌SHBG减少，引起胰岛素信号转导通路相关蛋白表达降低，从而导致胰岛素抵抗及GDM的发生。

妊娠期糖尿病；性激素结合蛋白；胰岛素抵抗；胰岛素受体底物；磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶；葡萄糖转运蛋白

性激素结合球蛋白（sex hormone⁃binding globu⁃lin，SHBG）是妊娠期糖尿病（gestational diabetes mel⁃litus，GDM）发病程度和预后的判定指标，参与包括胰岛素抵抗在内的代谢综合征的发生［1］，是胰岛素抵抗的一个标志［2］，在GDM发病中起重要作用。胰岛素信号传递介导细胞摄取葡萄糖：胰岛素与其受体α亚基结合后，诱发β亚基的酪氨酸残基自身磷酸化，并激活胰岛素受体的酪氨酸激酶，使胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate⁃1，IRS⁃1）和IRS⁃2的多个酪氨酸残基磷酸化，进一步非共价结合下游效应分子磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（phosphatidylinositol 3⁃kinase，PI3K）调节单位p85α，激活的PI3K调节末端葡萄糖转运蛋白（glucose transport protein，GLUT）［3⁃4］，其中任何一个环节改变都可导致胰岛素生物效应降低［5］。研究［6］发现孕期应用胰岛素治疗的GDM胎盘GLUT⁃4、PI3K蛋白和mRNA表达均减少，IRS⁃1蛋白表达明显增加，IRS⁃2蛋白表达下降。本研究应用Western blotting和实时PCR方法检测GDM和正常孕妇胎盘中SHBG、IRS⁃1、IRS⁃2和GLUT的表达情况及其相关性，旨在进一步探讨SH⁃BG是否影响胰岛素信号转导，从而导致胰岛素抵抗及GDM的发生。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔单克隆抗SHBG抗体、鼠单克隆GLUT⁃1抗体、兔多克隆抗GLUT⁃3抗体、鼠单克隆抗GLUT⁃4抗体、兔单克隆抗IRS⁃1抗体、兔单克隆抗IRS⁃2抗体、兔单克隆抗PI3K p85α抗体均购自英国Abcam公司。RNA引物由上海生工生物合成，TRIzol（Invi⁃trogen）和ABI high capacity cDNA RT kit（Applied Biosystems）逆转录盒及实时PCR相关试剂均购自日本TaKaRa公司。

1.2 研究对象及纳入标准

本研究在孕妇知情同意及医院伦理委员会同意后进行。选取2015年4月至2015年8月期间中国医科大学附属盛京医院定期就诊产检，住院符合剖宫产手术指征，择期剖宫产单胎足月（妊娠38～40周）孕妇。体质量指数（body mass index，BMI）＞25 kg/m2会增加Ⅱ型糖尿病风险［7］，因此选择BMI＜25 kg/m2非肥胖的GDM（GDM组）和同期糖代谢正常（正常组）孕妇的胎盘组织，每组各10例。

2组孕妇纳入标准：（1）孕前无糖尿病、高血压病、及心、肝、肾疾病病史；（2）无多囊卵巢综合征、垂体、肾上腺、甲状腺等内分泌疾病；（3）孕前及孕期未使用皮质激素类药物，未使用胰岛素类药物，或近1周未使用影响糖脂代谢药物；（4）无多胎、胎儿畸形、胎儿宫内生长受限或死胎分娩史；（5）近期无炎症、感染及创伤等其他应激状态；（6）产检及分娩资料完整的孕产妇；（7）无烟酒不良嗜好。采用2010年国际糖尿病与妊娠研究组推荐的GDM诊断标准［8］：妊娠24～28周，口服75 g葡萄糖行糖耐量试验（OGTT），诊断临界值为空腹、服糖后1 h和2 h的血糖分别为5.1 mmol/L、10.0 mmol/L和8.5 mmol/L，其中任何一项达到或超过界值即诊断为GDM。

1.3 标本收集

胎盘娩出后，立即在脐带附着处胎盘母体面底板区中央带随机取3块绒毛组织（约1 cm×1 cm×1 cm），冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干后储存在冻存管中，快速置于液氮中速冻4 h后-80℃贮存，用于胎盘组织mRNA的提取和胎盘组织SHBG和胰岛素转导通路蛋白的测定。

1.4 方法

1.4.1 Western blotting检测：提取总蛋白，加入裂解液充分裂解，低温高速离心（4℃，12 000 r/min，15 min），提取上清为总蛋白。蛋白上样量为40 μg。电泳（10%SDS⁃PAGE凝胶）、转印（75 V，90 min）、5%正常小牛血清封闭，一抗SHBG（1∶200，兔抗人单克隆IgG）、GLUT⁃1（1∶200，鼠抗人单克隆IgG）、GLUT⁃3（1∶200，兔抗人多克隆IgG）、GLUT⁃4（1∶200，兔抗人单克隆IgG）、IRS⁃1（1∶200，兔抗人单克隆IgG）、ISR⁃2（1∶200，兔抗人单克隆IgG）、PI3K p85α（1∶200，兔抗人单克隆IgG）、cyclin D1（1∶1 000，美国Cell Signaling公司），4℃孵育过夜，分别与对应的二抗（1∶2 500，美国Santa Cruz公司）室温孵育2 h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪（Chemi Im⁃ager 5500，美国Alpha Innotech公司）采集后进行灰度值测定。

1.4.2 实时PCR检测：实时PCR采用ABI（Applied Biosystems）SYBR Green Mastermix试剂盒。使用ABI 7500快速实时定量PCR系统，循环周期设定如下：95℃30 s，95℃5 s 40个循环，60℃30 s目的基因的相对表达量通过2-ΔΔCt方法计算。实验重复2次。引物序列：内参照β⁃actin上游引物5’⁃ATAG CACAGCCTGGATAGCAACGTAC⁃3’，下游引物5’⁃CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG⁃3’；SHBG上游引物为5’⁃CACTAGCCTCAGAAGCTGTGATGT⁃3’，下游引物为5’⁃GATTGAATTCTGCCTGAGTCCCT⁃3’；IRS⁃1上游引物为5’⁃GTCTGTCGTCCAGTAGCACC AG⁃3’，下游引物为5’⁃GGAACCAGACACCGAAGC ACT⁃3’；IRS⁃2上游引物为5’⁃CGCAGAACATCCAC GAGACC⁃3’，下游引物为5’⁃ACCCCGACGATTGGC TCT⁃3’；PI3Kp85α上游引物为5’⁃CGAGATGGCACT TTTCTTGTCC⁃3’，下游引物为5’⁃ATGCTTTACTTCG CCGTCCAC⁃3’；GLUT⁃1上游引物为5’⁃CCATTGGC TCCGGTATCGTC⁃3’，下游引物为5’⁃GCTCGCTCCA CCACAAACAG⁃3’；GLUT⁃3上游引物为5’⁃CCTTTG GCACTCTCAACCAGC⁃3’，下游引物为5’⁃AACCCA GTAGCAGCGGCCAT⁃3’；GLUT⁃4上游引物为5’⁃CC CTGATCATTGCGGTCGT⁃3’，下游引物为5’⁃CTGGC CTACCCCTGCTGTCT⁃3’。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料比较

2组孕妇年龄均在25～34岁，孕次1～3次，产次0～1次（既往可合并剖宫产手术史），月经周期规律。GDM组与正常组BMI、促甲状腺激素、血清游离甲状腺素和获取胎盘孕周均无统计学差异（P＞0.05）。GDM组患者空腹血糖、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、新生儿体质量均高于正常组（均P＜0.05），见表1。

表1 2组患者临床资料分析Tab.1 General clinical data of patients in the two groups

2.2 GDM组和正常组胎盘组织SHBG、IRS⁃1、IRS⁃2以及GLUT蛋白和mRNA表达比较

GDM组与正常孕妇胎盘组织中均存在SHBG表达，与正常组比较SHBG蛋白和mRNA表达均降低（均P＜0.05）。与正常组比较，GDM组孕妇胎盘组织中IRS⁃1蛋白、IRS⁃2mRNA表达降低（P＜0.05），而IRS⁃1mRNA、IRS⁃2蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）；PI3K p85α蛋白与mRNA表达均未见统计学差异（P＞0.05）。与正常组比较，GDM组胎盘组织中GLUT⁃1蛋白、mRNA表达未见统计学差异（P＞0.05）；GLUT⁃3、GLUT⁃4蛋白呈现明显低表达（P＜0.01），而GLUT⁃3mRNA表达未见统计学差异（P＞0.05）；GLUT⁃4mRNA表达降低（P＜0.05）。见图1、表2、表3。

2.3SHBGmRNA与其他指标直线回归依存关系分析

图1 GDM组和正常组胎盘组织SHBG、胰岛素信号转导和葡萄糖转运通路信号分子蛋白表达比较Fig.1 The representative Western blotting results of protein expressions of SHBG，IRS⁃1，IRS⁃2，PI3K p85α，GLUT⁃1，GLUT⁃3，and GLUT⁃4 in normal and GDM placental tissue

表2 GDM组和正常组胎盘组织SHBG、胰岛素信号转导和葡萄糖转运通路信号分子蛋白表达比较Tab.2 Comparison of the protein expressions of SHBG，IRS⁃1，IRS⁃2，PI3K p85α，GLUT⁃1，GLUT⁃3，and GLUT⁃4 in normal and GDM placental tissue

表3 GDM组和正常组胎盘组织SHBG、胰岛素信号转导和葡萄糖转运通路信号分子mRNA表达比较Tab.3 Comparison of mRNA expressions ofSHBG，GLUT⁃1，GLUT⁃3，GLUT⁃4，IRS⁃1，IRS⁃2，andPI3K p85αin GDM and normal pla⁃cental tissue

直线回归结果显示，SHBGmRNA与IRS⁃2mRNA、PI3K p85αmRNA、GLUT⁃4mRNA的表达呈正相关；IRS⁃2mRNA与GLUT⁃4mRNA的表达呈正相关；IRS⁃1mRNA与PI3K p85αmRNA、GLUT⁃3 mRNA的表达呈负相关；IRS⁃2mRNA与GLUT⁃1mRNA的表达呈正相关（均P＜0.05），见图2。

3 讨论

SHBG具有激素样作用，介导激素信号传导，特异性地结合和转运性激素；还可以通过与某些组织受体结合调节细胞的功能［9］。GDM与正常孕妇胎盘中均存在SHBG表达，与正常组比较SHBG蛋白、mRNA表达都降低（P＜0.05）。IRS在胰岛素受体通路中作为连接胰岛素受体（insulin receptor，IR）与PI3K p85α蛋白之间一个重要的传递介质，辅助胰岛素在细胞的生长与代谢中发挥多效性作用。结果显示GDM孕妇胎盘中IRS⁃1蛋白表达降低（P＜0.05）。TOMAZIC等［10］实验同样发现GDM孕妇骨骼肌和脂肪组织中IRS⁃1蛋白表达降低。

GLUT作为载体蛋白将单糖转运细胞，是胰岛素信号转导途径的最终步骤，其表达含量异常影响机体内葡萄糖稳态。既往研究［2］结果表明，GLUT⁃1是足月胎盘中主要的葡萄糖转运载体，负责母体循环与胎盘之间葡萄糖的转运，GLUT⁃3确保葡萄糖从胎盘血池转运到脐静脉。胰岛素敏感型GLUT⁃4参与胎盘绒毛的葡萄糖代谢，动力学研究［11］证实胰岛素可增加GLUT⁃4对葡萄糖转运的最大速率，在胎盘组织中表达非常少，却发挥重要作用。本研究中，GDM组GLUT⁃4无论在蛋白还是mRNA都存在低表达，GLUT⁃3蛋白呈现明显的低表达（P＜0.01）。XING等［4］在患有糖尿病的孕妇胎盘组织中同样发现GLUT⁃4蛋白和mRNA低表达，与本研究结果一致。

GDM孕妇胎盘内SHBG与GLUT⁃4表达呈现一致性降低，线性分析显示SHBGmRNA与GLUT⁃4 mRNA的表达正相关（P＜0.01）；本研究组的前期实验［6］发现SHBG与GLUT⁃4的表达在蛋白水平也呈正相关，XING等［4］实验发现胎盘中GLUT⁃4蛋白及其mRNA的表达降低与机体的胰岛素抵抗程度相关，而绝非是循环中胰岛素浓度的变化。SHBGmRNA与IRS⁃2mRNA的表达呈正相关（P＜0.05）；IRS⁃2mRNA与GLUT⁃4mRNA同样呈正相关（P= 0.002）；除此之外，IRS⁃2mRNA和GLUT⁃1mRNA的表达正相关（P=0.004）。胰岛素信号转导中IRS⁃2似乎发挥更大作用。尽管2组PI3K p85α蛋白表达无统计学差异，但GDM组PI3K p85αmRNA表达似乎存在异常，SHBGmRNA与PI3Kp85αmRNA的表达呈正相关（P＜0.05）。IRS⁃1mRNA与PI3K p85αmRNA、GLUT⁃3mRNA的表达呈负相关（P＜0.05）。

综上所述，GDM患者存在高胰岛素血症，胰岛素对调节SHBG的代谢具有重要的作用，高胰岛素血症可导致循环血SHBG减少，继而使性激素水平发生紊乱［7］，造成糖、脂肪代谢障碍，又进一步加重了胰岛素抵抗［12］。胰岛素信号转导通路蛋白表达的异常似乎伴随SHBG的变化，SHBG浓度降低可能影响着相关胰岛素信号转导蛋白分子，导致胎盘靶细胞摄取和利用葡萄糖障碍，与糖耐量异常密切相关，最终导致GDM的发生。

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（编辑 武玉欣）

Expression and Correlation of Sex Hormone⁃binding Globulin，Insulin Signal Transduction and Glucose Transporter Proteins in the Gestational Diabetes Mellitus Placental Tissue

ZHANG Bao，SUN Lei，ZHENG Yang，JIANG Jiexuan，JIN Zhen
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To study the expression of sex hormone⁃binding globulin（SHBG），insulin signaling pathway and glucose transporter in placenta of pregnant women with gestational diabetes mellitus（GDM），and to explore its role in the pathogenesis of GDM.Methods A total of 10 full⁃term and non⁃obese（BMI＜25 kg/m2）pregnancy women diagnosed with GDM and 10 normal pregnant cases were recruited for the study. Placental tissues were collected respectively.The expression of protein and mRNA of SHBG and insulin signal transduction（IRS⁃1，ISR⁃2，PI3K p85α）and glucose transporter proteins（GLUT⁃1，GLUT⁃3，GLUT⁃4）in placental tissue were detected by real⁃time PCR and Western blotting. Pearson and linear regression analysis were used to evaluate the correlation among the related indicators.Results In the placental tissue of non⁃obese women，there existed a decrease（P＜0.05）in the expression of protein and mRNA of SHBG with a concurrent a decrease（P＜0.05）in the expression of protein and mRNA of GLUT⁃4 in GDM women compared with normal controls.Furthermore，a decrease（P＜0.05）of GLUT⁃3 and IRS⁃1 protein expression with lower（P＜0.05）IRS⁃2mRNA expression was also observed in placental tissue from GDM patients.No changes were found in PI3K p85αand GLUT⁃1 at both protein and mRNA levels（P＞0.05）.Results of linear correlation analysis showed that there were positive correlations betweenSHBGmRNA andIRS⁃2mRNA（P＜0.05），SHBGmRNA andPI3K p85αmRNA（P＜0.05），andSHBGmRNA and GLUT⁃4 mRNA（P＜0.05）.There was also a remarkable positive correlation betweenIRS⁃2mRNA andGLUT⁃4mRNA（P＜0.01）.There existed negative correlations betweenIRS⁃1mRNA and PI3K p85αmRNA（P＜0.05），andIRS⁃1mRNA andGLUT⁃3mRNA（P＜0.05）.There existed a remarkable positive correlation betweenIRS⁃2mRNA andGLUT⁃1mRNA（P＜0.01）.Conclusion The defective receptors of insulinsignaling pathway are present in GDM placental tissue.Decreased expression of SHBG may be involved in the regulation insulin signaling，leading to a concomitant decrease expression of relevant insulin signaling components in placental tissue，implying insulin resistance and developing GDM finally.

gestational diabetes mellitus；sex hormone⁃binding globulin；insulin resistance；insulin receptor substrate；phosphati⁃dylinositol 3⁃kinase；glucose transport protein

R714.256

A

0258-4646（2017）02-0097-06

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.02.001

国家自然科学基金（81170591）；沈阳市科技计划（F11⁃262⁃9⁃46）

张宝（1990-），男，硕士研究生.

金镇，E-mail：jinzhen66@yahoo.com.cn

2016-03-07

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