脑组织特异表达hS100B转基因小鼠帕金森样运动协调能力改变的初步分析

刘嘉琳，郑 芳，龙 彦，佟 柳，郑 媛，刘小青，秦 川

1河北大学医学部病理教研室，河北保定 0710002保定市第一中心医院老年病科，河北保定 0710003中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心，北京 100021



·论 著·

脑组织特异表达hS100B转基因小鼠帕金森样运动协调能力改变的初步分析

刘嘉琳1，郑 芳2，龙 彦2，佟 柳2，郑 媛2，刘小青2，秦 川3

1河北大学医学部病理教研室，河北保定 0710002保定市第一中心医院老年病科，河北保定 0710003中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心，北京 100021

目的 研究S100B在帕金森病发病机制中的作用并探讨脑组织特异表达hS100B转基因小鼠作为帕金森病模型小鼠的可能性。方法 构建hS100B转基因小鼠。小鼠分为S100B转基因组、基因敲除组和阴性对照组。爬杆法和转棒法检测运动协调能力；逆转录-PCR、Western blot对脑组织中S100B、多巴胺D1、D2受体，G蛋白偶联受体激酶2、5及酪氨酸羟化酶的表达进行测定；高效液相色谱-荧光法检测脑组织中酪氨酸、左旋多巴、多巴胺及高香草酸的含量。结果 与阴性对照组相比，转基因组小鼠脑组织中S100B蛋白显著升高(P<0.05)，3月龄时可表现出运动协调能力下降，且随着月龄增加，运动协调能力下降呈明显的进行性降低(P<0.05)；脑组织中多巴胺D2受体、G蛋白偶联受体激酶2 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)；左旋多巴、多巴胺、高香草酸生成增多，高香草酸/多巴胺比值升高(P<0.05)；酪氨酸羟化酶的表达虽呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。S100B基因敲除小鼠脑组织中无S100B蛋白表达，与阴性对照组相比，各检测指标无异常(P>0.05)。结论 S100B很可能是参与帕金森病行为学异常的重要蛋白，脑组织特异表达hS100B转基因小鼠的建立为研究该基因在帕金森病中的作用提供了工具。

S100B；帕金森病；多巴胺受体；G蛋白偶联受体激酶；多巴胺

ActaAcadMedSin，2017,39(2)：240-246

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的中枢神经系统的老年变性疾病，临床主要表现为震颤、肌强直、运动减少、姿势及步态不稳等，晚期出现痴呆和抑郁。目前，PD确切的发病机制还不是十分清楚，对其进行较为深入的研究和探讨具有重要的意义。钙结合蛋白S100B被认为是脑内特异蛋白，生理量的S100B蛋白主要由星形胶质细胞产生，对中枢神经系统的发育、可塑性及损伤修复都是必不可少的，但在各种原因的脑损伤中，反应性的星形胶质细胞增殖与活化，产生大量的S100B蛋白，高浓度的S100B蛋白对中枢神经系统具有毒性作用，通过引起钙超载、升高NO浓度、导致神经纤维缠结、促进小胶质细胞的迁移及激活等途径诱导细胞凋亡[1]。在缺血性脑血管病、颅脑外伤、中枢神经系统感染、唐氏综合征、阿尔茨海默病等疾病中均发现S100B表达升高[2]。S100B可通过受损的血脑屏障进入血液，因此，升高的血清S100B蛋白可作为临床上脑损伤的标志。目前，在PD患者血清及1-甲基- 4-苯基- 1，2，3，6-四氢吡啶诱导的PD小鼠模型脑组织中均发现了S100B含量的升高，其表达与疾病的严重程度呈正比[3- 4]，笔者在α-synuclein A53T转基因小鼠PD模型中发现小鼠脑组织中S100B蛋白显著升高[5]，提示S100B的过表达可能参与了PD的发生发展，但具体分子机制方面的研究，目前国内外鲜见报道。本研究在构建脑组织特异表达hS100B转基因小鼠模型的基础上，结合S100B基因敲除小鼠模型，检测S100B在小鼠脑组织过表达和不表达的情况下，小鼠的运动协调能力、与运动协调能力有关的基底节神经环路中多巴胺D1受体(dopamine D1 receptor，D1DR)、多巴胺D2受体(dopamine D2 receptor，D2DR)、受体相关调控蛋白G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase，GRK)2、GRK5的表达以及多巴胺生成代谢途径中酪氨酸(tyrosine，Tyr)、左旋多巴(levodopa，L-DOPA)、多巴胺(dopamine，DA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量变化，进一步探讨S100B在PD发生发展中的作用。

材料和方法

实验动物 脑组织特异表达hS100B转基因小鼠本课题组前期已经成功构建及鉴定[5](批准号：GC- 08- 2014)，S100B基因敲除小鼠购自日本RIKEN BRC公司(BRC- 00804)，野生型C57BL/6J小鼠由中国医学科学院医学实验动物研究所资源中心提供，合格证号SYXK(京)2007- 0002。将F1代转基因小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，S100B基因敲除小鼠雌雄交配，提取后代鼠尾DNA，PCR法进行基因型鉴定，筛选阳性小鼠进行下一步实验。小鼠分为转基因组、基因敲除组及阴性对照组，每组14只，雄性，安静环境饲养，自由取食饮水，12 h昼夜节律。

试剂与仪器 Trizol试剂、逆转录试剂盒、PCR引物(Invitrogen，美国)，蛋白裂解液RIPA (碧云天公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体、Tyr、L-DOPA、DA、HVA对照品(Sigma，美国)，色谱纯乙腈(Tedia，美国)，BCATMProtein Assay Kit (Pierce，美国)，兔抗D1DR多克隆抗体(sc- 14001)、兔抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)多克隆抗体(sc- 14007)购自美国Santa Cruz公司，兔抗S100B单克隆抗体(ab52642)，兔抗D2DR多克隆抗体(ab76967)、兔抗GRK2多克隆抗体(ab137666)、兔抗GRK5多克隆抗体(ab64943)购自英国Abcam公司。电泳仪(Bio-Rad，美国)，半干电转仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，PCR仪(Effendorf公司，德国)，紫外分光光度计(Amersham，美国)，凝胶成像系统(Tiannon)，转棒仪(KN- 75，日本)，Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent，美国)，组织匀浆机(Fisher Scientific，美国)，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 (250×4.6 mm I.D.，5 μm)，预柱为Agilent Zorbax Extend C18(10×4.6 mm I.D.，5 μm)。

小鼠行为学检测 3组小鼠在3、6和9月龄时进行行为学检测。爬杆法：所用工具为直径13 mm、高760 mm的光滑不锈钢杆，垂直竖立，将小鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为，进行计分，评分标准如下：5分：四肢并用，一步一步协调向下爬行；4分：一步一步协调向下爬行，但兼有后肢滑行行为；3分：爬过一半距离后向下滑行，但可抱紧金属杆；2分：未爬过一半距离即出现滑行行为；1分：爬过一半距离后不能抓杆，从杆上掉落；0分：未爬过一半距离即不能抓杆，从杆上掉落。每只小鼠测定3次，每次间隔30 min，计算平均分。转棒法：实验前，每只小鼠训练5 min，使其能够在转棒仪上停留，随后休息2 min开始实验，转速为24 r/min，以300 s作为实验终止时间。每只小鼠测试5次，取平均值。

逆转录-PCR 每组小鼠随机选取8只，脱颈处死，去除小脑后，将一半脑组织迅速放入1 ml预冷的Trizol中冰上研磨。按Trizol试剂盒的说明要求，提取总RNA，并用DNA酶处理总RNA，琼脂糖凝胶电泳确定RNA未降解，紫外分光光度计测定浓度。使用逆转录试剂盒，将RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因的表达。目的基因检测所用引物见表1。

Western blot 将另一半脑组织加入RIPA裂解液，提取总蛋白，BCA法测定浓度，取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后将蛋白电转至聚偏二氟乙烯膜上。膜先在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入一抗(D1DR 1∶200；S100B 1∶1000；D2DR、GRK2、GRK5、TH为1∶500稀释)，4℃杂交过夜。将膜转移到辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体中(1∶10 000稀释)，室温杂交1 h。将膜置于化学发光液中，曝光、显影及定影。

表 1 目的基因检测所用引物

GAPDH：甘油醛- 3-磷酸脱氢酶；D1DR：多巴胺D1受体；D2DR：多巴胺D2受体；GRK：G蛋白偶联受体激酶

GAPDH：glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase；D1DR：dopamine D1 receptor；D2DR：dopamine D2 receptor；GRK：G protein-coupled receptor kinase

高效液相色谱荧光法 将每组剩余的6只小鼠脱颈处死后，在冰盘上迅速分离中脑组织，精密称重后，加入2 ml的冰甲醇，制备匀浆，加入100 μl氯仿-异丙醇涡旋混合、离心后提取上清液，高效液相色谱分离，检测参数：进样量10 μl；荧光检测波长激发波长=280 nm，发射波长=330 nm；柱温25 ℃；洗脱梯度如下：0～5 min，2%～5% (B)；5～13 min，5%～8% (B)；13～25 min，8%～15% (B)；26～30 min，25%～60% (B)；流速0.8 ml/min。检测峰值面积，依据标准曲线计算检测样本蛋白含量。

统计学处理 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，先进行数据的方差齐性检验，组间比较采用独立性t检验。

结 果

行为学检测结果 与阴性对照小鼠相比，3月龄转基因小鼠已经表现出运动协调能力下降，表现为行为学评分降低，在转棒仪上停留的时间缩短(P<0.05)，且随着月龄的增加，运动协调能力下降更加明显，而S100B基因敲除小鼠较阴性对照小鼠运动协调能力改变不明显(P>0.05)(图1、2)。

9月龄小鼠脑组织中D1DR、D2DR、GRK2、GRK5 mRNA的表达 与阴性对照组相比，S100B转基因小鼠脑组织中D2DR和GRK2 mRNA 表达明显降低(P<0.05)，而D1DR和GRK5 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，S100B基因敲除小鼠各检测指标均无改变(P>0.05)(图3)。

TG：转基因组；KG：基因敲除组；CG：对照组；与阴性对照组相比，aP<0.05

TG：transgenic group；KG：knockout group；CG：control group；aP<0.05 compared with negative control group

图 1 爬杆法的实验结果

Fig 1 The results of pole-climbing test

与阴性对照组相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with negative control group

图 2 转棒法的实验结果

Fig 2 The results of rota-rod performance

与阴性对照组相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with negative control group

A. 琼脂糖凝胶电泳检测各指标mRNA的表达情况；B. 各指标mRNA的相对表达

A. detection of target mRNA by agarose gel electrophoresis imaging；B. relative expression of target mRNA

图 3 D1DR、D2DR、GRK2、GRK5 mRNA在各组小鼠脑组织中的表达

Fig 3 mRNA expressions of D1DR，D2DR，GRK2，and GRK5 in the brain tissues of different groups mice

9月龄小鼠脑组织中S100B、D1DR、D2DR、GRK2、GRK5、TH蛋白的表达 S100B蛋白在转基因小鼠脑组织中的表达明显高于阴性对照组(P<0.05)，而在基因敲除小鼠脑组织中无表达。与阴性对照组相比，S100B 转基因小鼠脑组织中 D2DR 和 GRK2蛋白表达明显降低(P<0.05)，而 D1DR 和 GRK5蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，S100B基因敲除小鼠脑组织中各检测指标均无改变(P>0.05)。TH的表达虽在转基因小鼠脑组织中呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。

TH:酪氨酸羟化酶；Mr：相对分子质量；与阴性对照组相比，

aP<0.05

TH：tyrosine hydroxylase;Mr：relative molecular mass；aP<0.05 compared with negative control group

A.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测各指标蛋白的表达情况；B. 各指标蛋白的相对表达

A. detection of target protein by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis imaging；B. relative expression of target protein

图 4 S100B、D1DR、D2DR、GRK2、GRK5、TH蛋白在各组小鼠脑组织中的表达

Fig 4 The protein expressions of S100B，D1DR，D2DR，GRK2，GRK5，and TH in the brain tissues of different groups mice

9月龄小鼠脑组织中Tyr、L-DOPA、DA、HVA的含量 与阴性对照组相比，S100B 转基因小鼠脑组织中Tyr含量无变化(P>0.05)，但L-DOPA、DA、HVA 的含量及HVA/DA的比值显著增高(P<0.05)，S100B基因敲除小鼠各检测指标差异无统计学意义(P>0.05)(图5、6)。

讨 论

PD是一类发病机制尚不明确的神经系统退行性病变，S100B作为脑内特异蛋白，在PD患者血清及PD小鼠模型脑组织中均发现了其含量的升高。Schaf等[6]在检测了40例PD患者血清中S100B的含量后发现，S100B的表达水平与Hoehn-Yahr分级呈明显正相关，而与基本日常活动呈明显负相关，表明S100B可能参与了PD患者运动障碍的产生。运动障碍是PD患者的主要临床表现之一，PD模型小鼠会出现与人类PD患者类似的运动不能、减少或者迟缓等行为学改变。爬杆法和转棒法是目前检测小鼠运动协调能力较为常用的两种方法。本研究使用这两种方法对小鼠的行为学能力进行检测，发现结果是一致的：S100B转基因小鼠可表现出运动协调能力下降，且其同小鼠的增龄呈现相关关系。证实S100B过表达能够促进小鼠PD样运动障碍的出现。

Tyr：酪氨酸；L-DOPA：左旋多巴；DA：多巴胺；HVA：高香草酸；与阴性对照组相比，aP<0.05

Tyr：tyrosine；L-DOPA：levodopa；DA：dopamine；HVA：homovanillic acid；aP<0.05 compared with negative control group

图 5 Tyr、L-DOPA、DA及HVA在各组小鼠脑组织中的含量

Fig 5 The levels of Tyr，L-DOPA，DA，and HVA in the brain tissues of different groups mice

与阴性对照组相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with negative control group

图 6 各组小鼠脑组织中HVA/DA比值

Fig 6 The ratios of HVA/DA in the brain tissues of different groups mice

DA分别通过D1DR和D2DR在黑质纹状体直接和间接通路中发挥相反的功能，运动系统疾病，如PD，就是由直接和间接通路的失衡所导致的。与阴性对照组相比，S100B转基因小鼠脑组织中D1DR mRNA和蛋白未发生明显改变，D2DR mRNA和蛋白明显降低。Liu等[7]通过体内及体外实验均证实，S100B 可与D2DR结合而导致细胞外信号调节激酶1/2通路的激活以及腺苷酸环化酶活性的抑制，提示S100B可能作为D2DR一新的配体而介导D2DR的信号传导。多巴胺受体具有较强的可塑性，能随着生理病理条件的变化而出现表达变化，如：过多的DA作用于突触后D2DR可引起该受体表达下调[8]。笔者推测，由于S100B在转基因小鼠胚胎期就会出现高表达，D2DR可能在其配体长期作用下出现受体失敏而表达下调。D2DR的变化是PD病理改变中最主要的病变，缺少D2DR基因的动物表现为运动不佳、动作迟缓、自发性运动减少，与PD的临床症状相类似。D2DR的减少可导致DA能输出的降低，在间接环路中，从纹状体到苍白球的γ-氨基丁酸抑制功能过强，使椎体外系运动功能受到明显的抑制，导致小鼠运动协调能力降低。

激活的多巴胺受体可被GRKs磷酸化，抑制样蛋白随之结合到磷酸化的受体，使受体与G蛋白脱偶联并发生内吞，阻止受体本身再次偶联G蛋白，从而有效地降低细胞膜上功能受体的水平，使受体介导的信号转导效应消失或降低。其中，GRK2和GRK5的表达异常与PD的发病密切相关。本研究显示，S100B转基因小鼠脑组织中GRK5 mRNA和蛋白未发生改变，而GRK2 mRNA及蛋白随着D2DR表达降低而降低，提示D2DR与GRK2可能存在相互的协调作用。Namkung等[9]研究显示，GRK2过表达抑制D2DR在细胞表面的表达并增强激动剂诱导的D2DR的脱敏和内化，相反，RNA干扰技术抑制GRK2蛋白的表达后，可导致细胞表面D2DR表达升高而增强D2DR介导的信号传导。Daigle等[10]通过条件性基因敲除的方法使小鼠表达D2DR的神经元出现GRK2表达的缺失，结果显示D2DR的活性明显增强。Theilade等[11]研究显示，阻断ERK1/2途径可使GRK2表达降低，而D2DR介导ERK1/2途径的激活。推测在转基因小鼠脑组织中D2DR表达减少，可能降低ERK1/2途径的传导，而使依赖该途径的GRK2表达降低。而GRK2表达降低，可减少D2DR的内吞作用，使其在细胞表面分布增多，进而与G蛋白重新偶联，增强D2DR介导的信号传导作用，发挥机体的反馈调节作用，其可能是对S100B过表达引起的D2DR表达水平降低的补偿作用或者负反馈作用。研究显示GRK2+/-小鼠与野生型小鼠相比，肿瘤坏死因子-α在脑组织中的含量明显升高，且该小鼠大脑神经元对神经兴奋性毒素鹅膏蕈氨酸及谷氨酸诱导的细胞毒性更加敏感[12]。所以，S100B转基因小鼠GRK2表达的降低，一方面可以反馈性增强D2DR介导的信号传导，另一方面却发挥不利作用，导致脑组织对损伤的敏感性增强。

D2DR作为一种特异的自身受体，在调节DA神经元放电、合成、释放与重摄取方面发挥着重要的作用。研究显示DA生物合成的负反馈调控是由突触前D2DR介导的，与D1DR无关[13]，D2DR基因敲除小鼠DA生成及代谢明显增强[14]。与阴性对照相比，S100B转基因小鼠脑组织中Tyr的含量未发生改变，L-DOPA、DA含量明显增多，但其催化酶TH含量无变化，提示在该转基因小鼠脑内可能存在TH的活性升高。TH多个丝氨酸位点发生磷酸化均可导致该酶活性的升高，Stoof和Kebabian[15]研究显示，D2DR拮抗剂通过减弱D2DR对cAMP的抑制作用而促进TH Ser 40位点磷酸化的发生。推断D2DR通过抑制性Gi与腺苷酸环化酶的活性负偶联，抑制依赖cAMP的蛋白激酶A对TH Ser 40位点的磷酸化激活，从而抑制DA的生物合成，S100B过表达通过降低D2DR的表达而减弱这种抑制作用，促进cAMP依赖的TH Ser 40位点的磷酸化。当然，在转基因小鼠脑内TH的活化可能是一个多位点磷酸化的过程，这有待于更深一步的研究。

DA不仅是内源性神经递质，其自身的生理生化特点决定了它极易处于氧化应激状态，DA经单胺氧化酶B或儿茶酚胺氧位甲基转移酶进行降解生成HVA过程中及自身发生非酶促氧化生成半醌和醌的过程中均伴有大量活性氧的生成，对神经系统产生氧化损伤。在S100B转基因小鼠脑内DA含量及HVA/DA比值的升高，提示存在过度活跃的DA代谢，导致大量活性氧的生成，活性氧通过攻击生物膜和组织的脂质、蛋白质，诱导炎性细胞因子及凋亡相关蛋白的生成等途径，引发或加剧多巴胺能神经元的凋亡。

TH是脑内DA神经元的蛋白标志。与阴性对照组相比，TH在转基因小鼠脑组织中呈下降趋势，但差异无统计学意义，表明转基因小鼠未出现明显的DA神经元不可逆性损伤，损伤因子作用下，由于机体的调控作用，神经元首先出现可逆性损伤，只有损伤因子持续作用超过机体的适应能力后才会出现不可逆性损伤，而PD作为一种老年神经系统退行性疾病，其DA神经元的损伤也是多种致病因素长期作用的结果，故这一现象可能与小鼠的年龄及病程的进展有关，需要进一步研究与观察。

S100B基因敲除小鼠与阴性对照组小鼠相比，各检测指标均无改变。Schulte-Herbrüggen等[16]对10月龄S100B基因敲除小鼠海马、皮层多巴胺、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸含量进行检测，这些物质的含量与野生型小鼠相比未发现异常，并且S100B基因敲除小鼠较野生型小鼠相比，脑组织中神经营养因子表达无改变，但脑源性生长因子表达升高。表明虽然生理量的S100B对脑组织发挥营养保护作用，但这种作用可能是非必需的，在其缺乏时，其他营养因子也许发挥了营养代偿作用。

因此，S100B过表达通过降低脑组织中D2DR、GRK2的含量，促进DA的合成及代谢而参与PD的发生发展，抑制其过表达有可能为临床PD的治疗提供新的研究思路和方向。

[1]Sorci G，Riuzzi F，Arcuri C，et al. S100B protein in tissue development，repair and regeneration [J]. World J Biol Chem，2013，4(1)：1- 12.

[2]吴珊珊，范宇威，高静，等. S100B蛋白在神经系统疾病中的临床意义及进展 [J]. 现代生物医学进展，2015，15(16)：3197- 3200.

[3]Wilhelm KR，Yanamandra K，Gruden MA，et al. Immune reactivity towards insulin，its amyloid and protein S100B in blood sera of Parkinson’s disease patients [J]. Eur J Neurol，2007，14(3)：327- 334.

[4]Sathe K，Maetzler W，Lang JD. S100B is increased in Parkinson’s disease and ablation protects against MPTP-induced toxicity through the RAGE and TNF-α pathway [J]. Brain，2012，135(11)：3336- 3347.

[5]刘嘉琳，王海林，全雄志，等. 脑组织特异表达S100B转基因小鼠的建立[J]. 中国比较医学杂志，2010，20 (4)：24- 27.

[6]Schaf DV，Tort AB，Fricke D，et al. S100B and NSE serum levels in patients with Parkinson’s disease [J]. Parkinsonism Relat Disord，2005，11(1)：39- 43.

[7]Liu Y，Buck DC，Neve KA. Novel interaction of the dopamine D2 receptor and the Ca2+binding protein S100B：role in D2 receptor function [J]. Mol Pharmacol，2008，74(2)：371- 378.

[8]Nakao N，Shintani MA，Kakishita K. The ability of grafted human sympathetic neurons to synthesize and store dopamine：a potential mechanism for the clinical effect of sympathetic neuron autografts in patients with Parkinson’s disease [J]. Exp Neurol，2004，188(1)：65- 73.

[9]Namkung Y，Dipace C，Urizar E，et al. G protein-coupled receptor kinase- 2 constitutively regulates D2 dopamine receptor expression and signaling independently of receptor phosphorylation [J]. J Biol Chem，2009，284(49)：34103- 34115.

[10]Daigle TL，Ferris MJ，Gainetdinov RR，et al. Selective deletion of GRK2 alters psychostimulant-induced behaviors and dopamine neurotransmission [J]. Neuropsychopharmacology，2014，39(10)：2450- 2462.

[11]Theilade J，Lerche Hansen J，Haunsø S，et al. Extracellular signal-regulated kinases control expression of G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) [J]. FEBS Lett，2002，518(1- 3)：195- 199.

[12]Degos V，Peineau S，Nijboer C，et al. G protein-coupled receptor kinase 2 and group Ⅰ metabotropic glutamate receptors mediate inflammation-induced sensitization to excitotoxic neurodegeneration [J]. Ann Neurol，2013，73(5)：667- 678.

[13]Hu G，Jin GZ. (-)-Stepholidine antagonizes the inhibition by D2 receptor agonists on synaptosomal tyrosine hydroylase in rat corpus striatum [J]. Zhongguo Yao Li Xue Bao，1995，16(4)：376- 379.

[14]Parish CL，Finkelstein DI，Drago J，et al. The role of dopamine receptors in regulating the size of axonal arbors [J]. J Neurosci，2001，21(14)：5147- 5157.

[15]Stoof JC，Kebabian JW. Opposing roles for D- 1 and D- 2 dopamine receptors in efux cyclic AMP from rat neostriatum [J]. Nature，1981，294(5839)：366- 368.

[16]Schulte-Herbrüggen O，Hörtnagl H，Ponath G，et al. Distinct regulation of brain-derived neurotrophic factor and noradrenaline in S100B knockout mice [J]. Neurosci Lett，2008，442(3)：100- 103.

Preliminary Analysis of Parkinson-like Motor Coordination Abnormity in Brain-specific hS100B Transgenic Mice

LIU Jialin1，ZHENG Fang2，LONG Yan2，TONG Liu2，ZHENG Yuan2，LIU Xiaoqing2，QIN Chuan3

1Department of Pathology，Hebei University Medical College，Baoding，Hebei 071000，China2Department of Geratology，the First Central Hospital of Baoding，Baoding，Hebei 071000，China3Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences， Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

Corresponding author：QIN Chuan Tel：010- 67779915，E-mail：qinchuan0111@outlook.com

Objective To investigate the role of S100B in the development of Parkinson’s disease (PD) and explore the possibility of brain-specific S100B transgenic mice as PD animal model. Methods The hS100B transgenic mice were established. The mice were divided into S100B transgenic group (TG)，S100B knockout group (KG)，and the non-transgenic control group (CG). Motor coordination ability of mice was measured by the rota-rod and pole-climbing test. The expressions of S100B，dopamine D1 receptor，dopamine D2 receptor，G protein-coupled receptor kinase (GRK)2，GRK5，and tyrosine hydroxylase in brain tissue were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blot. The levels of tyrosine,levodopa，dopamine，and homovanillic acid in brain tissue were measured by high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection. Results Compared with CG，the S100B protein expression in brain tissue significantly increased in TG (P<0.05)；the motor coordination ability of mice showed progressive decline (P<0.05)；the mRNA and protein expressions of dopamine D2 receptor and GRK2 significantly decreased (P<0.05)；the levels of levodopa，dopamine，and homovanillic acid were significantly elevated (P<0.05)；the expression of tyrosine hydroxylase was also down-regulated，although there was no significant difference (P>0.05). Compared with CG，there was no obvious change of the above indicators in KG (allP>0.05). Conclusions S100B plays an important role in the motor coordination abnormity of PD. The brain-specific S100B transgenic mice can be used in research on the role of S100B gene in the development of PD.

S100B;Parkinson’s disease;dopamine receptor;G protein-coupled receptor kinase;dopamine

保定市科学技术研究与发展指导计划(14ZF003)、河北大学医学学科建设基金(2014A1002)和河北大学博士科研启动基金(一省一校专项经费)Supported by Baoding Sciences and Technology Research and Development Program (14ZF003)，Development Fund for Hebei University Medical Science (2014A1002)，and Research Fund for the Doctoral Program of Hebei University (Special Funds for A Provincial University)

秦 川 电话：010- 67779915，电子邮件：qinchuan0111@outlook.com

R741

A

1000- 503X(2017)02- 0240- 07

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.02.013

2016- 01- 04)