天麻共生蜜环菌液体种培养基的优化

唐兴国，王伯诚，赖小芳

(台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000)

天麻共生蜜环菌液体种培养基的优化

唐兴国，王伯诚，赖小芳

(台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000)

在传统蜜环菌母种培养基(加富PDA)基础上，通过正交试验获得一种蜜环菌液体种改良培养基配方(栎树枝100 g·L-1，毛竹根50 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，马铃薯200 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然)。在此培养基上培养的蜜环菌菌球个体更大，菌丝体活力更强，培养14 d后蜜环菌菌丝体产量可达0.803 2 g·100 mL-1，为原配方的2.98倍。

蜜环菌； 天麻； 摇瓶培养； 培养基

蜜环菌(Armillariamellea)是一种药食兼用菌[1]，与药用植物天麻(Gastrodiaelata)和真菌猪苓(Polyporusumbellatus)相伴生[2]，蜜环菌是天麻无性繁殖阶段的唯一营养源[1]。在生产上，天麻种植用蜜环菌菌种分为母种(一级)、原种(二级)和栽培种(三级)。从野生环境中分离纯化得到的母种经扩大培养成为生长旺盛的原种，原种接种于固体培养基形成用于生产的栽培种。菌种质量的好坏直接影响生产中菌材菌索的数量及健壮程度，而后者则决定了天麻的质量和产量[3]。

目前生产上常用固体加富PDA培养基培养母种，其缺点是菌丝易于老化、菌索细弱长势较差[4]。原种则多采用固体木屑培养基或液体加富PDA培养基[1, 3]，固体木屑培养基培育的原种质量较好，但是培养基配制繁琐，培养周期偏长[5-6]；液体加富PDA培养基上培养的蜜环菌长势一般，难以满足生产用种需要。目前有关蜜环菌液体培养方面的研究主要集中于工业发酵领域，研究所得的培养基和培养条件并不适合在天麻种植中推广应用[7-8]。本试验拟在前人工作基础上对蜜环菌摇瓶液体种培养基进一步优化，以期筛选出菌丝体性状优良且高产的液体种培养基配方。

蜜环菌在自然界最常见的宿主为壳斗目阔叶硬质杂木，包括麻栎、青冈栎、栗树等[1, 3]。长期以来，人们在生产上也主要选择栎树作为基材培育蜜环菌[1, 3, 5-6]，进而人工栽培天麻。因此，考虑向培养基中加入栎树枝浸提液进行优化。此外，笔者在生产实践中观察到，蜜环菌对毛竹根有较强的附着腐生能力，故考虑在培养基中加入毛竹根浸提液进行培养试验，期望通过研究证实毛竹根在蜜环菌生长中的营养支持作用，为用毛竹替代传统基材进行蜜环菌培育和天麻栽培积累经验。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种。蜜环菌(Armillariamellea)母种，采集于浙江省仙居县朱溪镇山后陈村天麻原生地，分离纯化后保存在加富PDA培养基上待用。

试管种扩繁培养基[3]。马铃薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，琼脂18 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1。

摇瓶液体母种培养基[3]。马铃薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。

1.2 处理设计

试管种扩大培养。将试管原种切成0.5 cm×0.5 cm的方块，接入试管种扩繁培养基斜面，28 ℃暗培养，待菌丝长满后留作母种。

摇瓶液体母种的制备[9]。将试管母种切成0.5 cm×0.5 cm的方块，接入摇瓶液体母种培养基，250 mL三角瓶每瓶装入培养基100 mL，接种量4块。接种后于28 ℃避光静置24 h，待菌丝修复后，避光条件下28 ℃、120 r·min-1摇瓶培养3～5 d，至菌液呈浅红色，即制得摇瓶液体母种。

二级摇瓶培养基的筛选。采用正交设计对液体母种培养基进行优化，在原培养基基础上加入栎树枝和毛竹根浸提液，并改变碳源种类及马铃薯用量，各因素水平组合见表1。

摇瓶培养的其他参数设置。装液量100 mL/250 mL，接种量5 mL/100 mL，摇床转速120 r·min-1，28 ℃暗培养14 d[10-11]。

菌丝生物量测定。发酵结束后真空抽滤收集菌丝体，温水冲洗除去附着在菌索上的培养基[9]，65 ℃烘干至恒质量，测量菌丝体干质量(g·100 mL-1)。

L9(34)因素水平。1～3水平，因素A(栎树枝)分别为0、50和100 g·L-1，B(毛竹根)分别为0、50和100 g·L-1，C(碳源)分别为葡萄糖20 g·L-1,蔗糖20 g·L-1,果糖20 g·L-1，D(马铃薯)分别为50、100和200 g·L-1。实验中各种不溶性固体添加物均采用浸提液，具体操作程序：去皮去杂→定量称取→清水煮沸40 min→6层纱布过滤→滤液全部加入培养基中。

1.3 数据处理

实验数据全部运用SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 二级摇瓶培养基的正交试验优化

从表1可以看出，A、B、C、D对蜜环菌菌丝体生物量的影响R值分别为0.382 4、0.082 0、0.108 0、0.141 6 g·100 mL-1。因此，各因素对菌丝体生物量的影响大小次序为栎树枝>马铃薯>碳源>毛竹根。

表1 蜜环菌液体发酵各因素水平下的菌丝体干质量

注：1～5表示每个处理测了5个摇瓶的菌丝体干质量。

方差分析结果显示，栎树枝的F=87.370，P=0<0.01；毛竹根的F=4.947，P=0.013<0.05；碳源的F=6.703，P=0.003<0.01；马铃薯的F=13.731，P=0<0.01。这表明试验中栎树枝、碳源和马铃薯对蜜环菌菌丝体生物量的影响均达到了极显著水平，而毛竹根对蜜环菌菌丝体生物量的影响也达到了显著水平。因此，需要进一步进行各因素水平间的多重比较以了解其具体差异。

由表2可以看出，栎树枝的3个水平之间的差异均达到极显著水平；毛竹根的水平2与水平1、3之间的差异达到显著水平，但水平1与水平3之间没有显著差异；碳源的水平1与水平3之间的差异达到极显著水平，水平2与水平3之间的差异也达到显著水平，但水平1与水平2之间没有显著差异；马铃薯的水平3与水平1、2之间的差异达到极显著水平，但水平1与水平2之间没有显著差异。这说明在蜜环菌液体发酵过程中，选择葡萄糖或蔗糖作为碳源，并向培养基中添加较高水平的栎树枝和马铃薯浸提液，同时添加适量毛竹根浸提液将有利于蜜环菌菌丝体生物量的积累。实验筛选出的优化培养基组合为A3B2C1D3，即实验中的处理8。由于葡萄糖与蔗糖在本实验中并未表现出较显著差异，因此，考虑以成本较低廉的蔗糖替代葡萄糖作为碳源，故最终确定的优化组合为A3B2C2D3。

表2 各因素水平间的差异显著性

2.2 优化后的二级摇瓶培养基与常规加富PDA培养基的比较

常规加富PDA培养基：马铃薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。

优化后的二级摇瓶培养基：栎树枝100 g·L-1，毛竹根50 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，马铃薯200 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。

将同一批摇瓶液体母种分别接入上述2种培养基进行摇瓶培养，装液量100 mL/250 mL、接种量5 mL/100 mL、摇床转速120 r·min-1、28 ℃暗培养14 d。发酵结束后统计菌丝体生物量。结果显示：优化后的二级摇瓶培养基和常规加富PDA培养基上的蜜环菌菌丝体生物量分别为0.803 2和0.269 8 g·100 mL-1，菌球直径分别为3～5和1～3 mm，颜色分别为黄褐色和淡黄色。另外，优化后的二级摇瓶培养基中蜜环菌菌球数目更多，个体更大，同时部分菌球表面有清晰可见的菌索状突起，这表明在此条件下培养的蜜环菌菌丝体生长旺盛、活力更强[9]。

3 小结与讨论

本试验筛选出了新的摇瓶培养基配方：栎树枝100 g·L-1，毛竹根50 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，马铃薯200 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，VB110 mg·L-1，pH自然。蜜环菌在此培养基上摇瓶培养(装液量100 mL/250 mL、接种量5 mL/100 mL、摇床转速120 r·min-1、28 ℃暗培养)14 d，菌丝体生物量可达0.803 2 g·100 mL-1，为常规加富PDA培养基的2.98倍，而且在此培养基上摇瓶培养的蜜环菌菌丝体生长旺盛、活力更强。

本试验通过正交设计对蜜环菌摇瓶液体母种培养基进行了优化，在常规加富PDA培养基的基础上引入了栎树枝浸提液、毛竹根浸提液2种附加成分，并尝试改用不同碳源进行培养试验。试验初步证实，在蜜环菌摇瓶培养过程中，向培养基中添加较高水平的栎树枝和马铃薯浸提液，同时添加适量毛竹根浸提液有利于蜜环菌菌丝体生物量的积累。栎树枝和马铃薯2种天然附加物对蜜环菌的生长起到了重要的营养支持作用，这与前人的研究[8-9]以及生产实践中观察到的现象一致。试验中还观察到，添加毛竹根浸提液对蜜环菌生物量的积累具有正向促进作用，但这种正向促进作用并没有随着添加量的增加而提升。目前同类研究中尚未见到相关报道，其作用机理有待进一步深入研究。从本次试验的效果来看，尚不能确认毛竹根可否作为蜜环菌培育的主要基材，需要在后续工作中进一步证实。

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(责任编辑：侯春晓)

2017-01-19

台州市市级科技资金项目(131KY23)

唐兴国(1979—)，男，湖北宜昌人，农艺师，硕士，从事珍稀药用植物与药用菌的开发及应用研究工作，E-mail: ahgotang@hotmail.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170428

S646.2

A

0528-9017(2017)04-0635-03

文献著录格式：唐兴国，王伯诚，赖小芳. 天麻共生蜜环菌液体种培养基的优化[J].浙江农业科学，2017，58(4)：635-637.