恒温扩增实时荧光检测技术检测痰液对肺结核患者诊断价值的Meta分析

孙宝彬 谢明娟 陈效友



恒温扩增实时荧光检测技术检测痰液对肺结核患者诊断价值的Meta分析

孙宝彬 谢明娟 陈效友

目的 评估结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时荧光检测技术(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)检测痰液标本对肺结核的快速诊断价值。方法 检索中国学术期刊全文数据库(CNKI)、万方数据库、维普数据库、PubMed、ScienceDirect和Cochrane图书馆等数据库，收集有关探讨SAT-TB检测痰液对肺结核诊断价值的所有文献，检索起止时间为建库至2016年12月。拟定入选标准、排除标准，2名研究者分别独立进行文献资料提取及文献质量评估，采用软件Meta-DiSc 1.4进行Meta分析。结果 共检索出168篇文献，依据入选标准和排除标准，纳入了9篇文献进行分析，包含了5137例临床患者痰标本，所有标本均进行了SAT-TB检测和痰结核分枝杆菌培养。9篇文献质量采用QUADAS-2评价表评价，文献偏倚风险主要为患者选择方面。Meta分析结果显示，SAT-TB法检测痰液诊断肺结核的汇总敏感度为87.0%(95%CI:86.0%～89.0%)，特异度为90.0%(95%CI:88.0%～91.0%),阳性似然比(positive likelihood ratio，PLR)为6.91(95%CI:4.04～11.84)，阴性似然比(negative likelihood ratio，NLR)为0.09(95%CI:0.06～0.15)。 结论 SAT-TB检测痰液对肺结核快速诊断具有较高的敏感度和特异度，值得临床进一步推广应用。

结核，肺； 诊断技术和方法； 核酸扩增技术； Meta分析(主题)

结核病仍旧是威胁着人类健康的主要问题之一。据世界卫生组织估计，2015年全球新增结核病患者约1040万例，死亡约140万例；我国仍然是一个结核病高负担国家[1]，结核病的防治形势依然严峻。结核病的诊断方法目前主要包括痰涂片镜检、培养法、免疫学诊断、分子生物学诊断技术[2-3]。然而痰涂片镜检敏感度较低，虽然培养法有较高的敏感度，但耗时较长，至少需要3～8周。免疫学诊断技术如γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay, IGRA)主要用于结核潜伏感染的诊断，在活动性结核病诊断中的价值尚未得到公认。随着分子生物学技术的发展，近年来涌现出许多可用于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)快速诊断及鉴定的方法[4]。但传统扩增DNA的检测方法易受环境污染的影响，存在假阳性，同时，由于核酸扩增中抑制物的存在，可出现假阴性，给临床诊断带来困扰。结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时荧光检测技术(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)是以MTB特异的16S rRNA为靶标，通过恒温扩增RNA技术，荧光标记探针与靶标片段的扩增产物杂交后释放出荧光信号，通过对荧光信号进行实时监测，因简化了检测方法和针对RNA进行扩增而有效降低了实验室污染造成的假阳性[5-6]，且其检测结果可作为区分死菌和活菌的依据，理论上有利于用药后的疗效监测[7]。SAT-TB检测法是国内研发具有知识产权专利保护的新颖方法，自2010年开始在临床使用以来，近期发表的研究证明了SAT-TB在快速诊断肺结核方面具有独特的优势。本研究收集了所有相关文献，采用Meta分析评估SAT-TB技术检测痰液在肺结核中的诊断价值。

方 法

1. 文献纳入标准：①采用痰标本SAT-TB技术诊断肺结核；②诊断试验采用痰液MTB培养阳性作为诊断肺结核的金标准；③诊断试验具有获取诊断价值评估的所有数据，即敏感度、特异度或真阳性值(true positive，TP)、假阳性值(false positive，FP)、真阴性值(true negative，TN)及假阴性值(false negative，FN)；④研究对象必须是来自临床疑似肺结核患者，入选研究必须是临床诊断试验；⑤发表检索的文献语种为中文和英文。

2.文献排除标准：①检测标本为非痰标本的研究；②缺乏诊断试验的敏感度或特异度或其他重要诊断数据；③非临床诊断试验，而是实验室研究；④肺结核的诊断标准非细菌学阳性作为依据，比如以临床诊断作为判断肺结核的标准；⑤发表的语种非英文及非中文，非论著形式发表，摘要、信函等形式的文献均排除在外。

3. 文献检索策略：结合如下关键词进行检索。以“SAT-TB及肺结核”、“RNA恒温扩增及肺结核”；“SAT-TB and pulmonary tuberculosis”、 “amplification RNA and tuberculosis”、“simultaneous amplification and pulmonary tuberculosis”等进行中文及英文关键词检索中国知网、万方数据库和维普数据库、PubMed、ScienceDirect和Cochrane图书馆数据库，检索起止时间均为建库至2016年12月31日。

4. 文献筛选和资料提取：由孙宝彬和谢明娟对文献进行筛选，并制定资料提取表格对文献资料进行提取和录入，交叉核对。提取内容包括：作者、发表时间、国家、标本种类、纳入患者例数及诊断试验评估需要的主要参数(TP、FP、TN、FN等)。

5. 文献质量评价：诊断性试验的文献质量以QUADAS-2(quality assessment of diagnostic accuracy studies)评价表进行评价[8]，评价内容包括：(1)患者选择：选择的患者是否会产生偏倚；(2)待评价试验：待评价试验的实施或解释是否会产生偏倚；(3)金标准：金标准的实施或解释是否会产生偏倚；(4)患者诊断流程和进展情况：患者诊断的流程是否会产生偏倚。每项分别按标志性问题具体评价，每条标志性问题以“是”、“否”、“不清楚”评价，偏倚评估分为“高风险”、“低风险”、“不清楚”3个等级，若所有标志性问题的答案均为“是”，则该方面的偏倚评估为“低风险”；若有一个标志性问题的答案为“否”，则偏倚评估为“高风险”；若文献中没有详细的内容判断标志性问题，则风险评估为“不清楚”。其中前3个方面还需要进行临床适用性评估，主要是判断其与评价问题的匹配程度，也是分为“高风险”、“不清楚”、“低风险”3个等级，判断方法与偏倚评估原理相同。由孙宝彬和谢明娟独立评价文献质量，如遇分歧通过与陈效友讨论解决。

6. 统计学方法：用Meta-DiSc 1.4版软件进行Meta分析。计算汇总敏感度(pooled sensitivity)、汇总特异度(pooled specificity)、阳性似然比(positive likelihood ratio, PLR)、阴性似然比(negative likelihood ratio，NLR)，并进行异质性分析，如各研究间异质性检验结果I2>50%，表明各研究间存在高度异质性，则采用随机效应模型分析；如各研究间异质性检验结果I2≤50%，表明各研究间存在较小异质性，则采用固定效应模型分析，并绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，同时计算曲线下面积(AUC)。

结 果

1. 入选文献：共检索文献168篇 (CNKI 61篇，万方数据库54篇，维普数据库 10篇，PubMed 6篇，ScienceDirect 37篇，Cochrane图书馆数据库 0篇)，其中中文94篇，英文74篇。通过阅读168篇文献的文题、摘要及全文后，对非痰检测标本、无明确诊断标准及无法获得全文的文献进行排除，对符合纳入标准的9篇进行Meta分析,包括中文7篇，英文2篇。

图1 文献纳入及排除流程图

2.纳入文献相关信息及文献质量：9篇文献[5,9-16]共纳入5137例患者送检的临床痰标本，一般情况如表1所示。按QUADAS-2评价表评价9篇文献研究质量，患者选择偏倚评估，8篇高风险，1篇不清楚，其临床适应性评估均为高风险；待评价试验偏倚评估，9篇均为不清楚，其临床适应性评估均为低风险；金标准偏倚评估，9篇均为不清楚，其临床适应性评估均为低风险；患者诊断流程和进展偏倚评估，8篇低风险，1篇高风险；纳入的文献总体质量合格。其中文献[5,9-10,13-14,15-16]未提及是否为连续随机病例；文献[5,9-11,13-14,15-16]未避免病例对照类研究设计；文献[5,9，13-14,15-16]未避免不恰当的患者排除；9篇文献均未提及待评价试验与金标准是否施盲。QUADAS-2评价信息如表2。

3. Meta分析结果：纳入的9篇文献报道了SAT-TB技术检测痰液对肺结核的诊断价值。异质性检验，I2>50%(敏感度I2=88.8%，特异度I2=95.1%，PLRI2=95.3%,NLRI2=89.9%),P值均<0.01，提示研究间存在异质性，均采用随机效应模型进行Meta分析。结果提示(图2～5)汇总敏感度为87.0%(95%CI:86.0%～89.0%)，特异度为90.0%(95%CI:88.0%～91.0%),PLR为6.91(95%CI:4.04～11.84)，NLR为0.09(95%CI:0.06～0.15)。SAT-TB技术诊断肺结核ROC曲线的AUC为0.9699(图6)。

讨 论

一、SAT-TB 的工作原理

SAT-TB是一种核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的新型核酸检测技术[17]，通过恒温扩增MTB的RNA，荧光标记探针与靶标片段的扩增产物杂交后释放出荧光信号，对荧光信号进行实时检测，具有检测速度快、效率高等特点。该项技术由于是国内研发，率先在国内临床使用，因此近年来涌现了一批国内发表的SAT-TB对肺结核的诊断价值的研究。

表1 纳入9篇文献的相关信息

注 TP：真阳性值；FP：假阳性值; TN:真阴性值；FN：假阴性值

表2 纳入研究的相关质量评价信息情况

注 LR：低风险；HR：高风险;UR:无风险

图2 SAT-TB技术检测痰诊断肺结核的敏感度

图3 SAT-TB技术检测痰诊断肺结核的特异度

图4 SAT-TB技术检测痰诊断肺结核的阳性似然比

图5 SAT-TB技术检测痰诊断肺结核的阴性似然比

图6 SAT-TB技术检测痰诊断肺结核的ROC曲线

二、痰液SAT-TB诊断肺结核的效率评价

从本研究筛选、收集的9篇研究结果分析，发现SAT-TB检测痰标本在快速诊断肺结核方面具有较高的敏感度和特异度，以痰培养阳性作为诊断肺结核的金标准，结果显示痰SAT-TB诊断肺结核的敏感度和特异度分别为87.0%(95%CI:86.0%～89.0%)和90.0%(95%CI:88.0%～91.0%)，且具有较高的PLR和较低的NLR。与其他痰分子生物学诊断技术进行比较,欧喜超等[18]以痰培养为标准，发现环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的敏感度和特异度分别为90.24%、96.86%，于霞等[19]同样指出LAMP的敏感度和特异度为90.07%和93.33%。Moussa等[20]研究发现GeneXpert MTB/RIF敏感度和特异度为93.0%和98.3%。Yan等[21]分别对比了LAMP和GeneXpert MTB/RIF技术，发现SAT-TB技术诊断肺结核的敏感度最高为96.0%，但特异度最低为88.0%。

三、异质性分析

从该项研究的结果分析，9项研究之间存在较高的异质性，分析异质性产生的原因，可能与各项研究开展的实验室PCR条件的不同、标本储存的时间、标本前处理的方法、检测人员操作原因等因素的干扰有关。两项检测痰液及支气管肺泡灌洗液SAT-TB的研究中发现，在同一实验室不同工作时间SAT-TB的检出率均存在差异，检测效率与标本冻存时间、标本运输等因素相关[22-23]。以上可能是构成存在较高异质性的原因。在该项技术未来的临床使用中对影响其检测效率的因素将会发现更成熟的方法来降低其影响。

9篇文献按QUADAS-2评价表评价后显示，患者选择方面偏倚风险较高，其中7篇患者选择偏倚为高风险，此外，9篇文献的金标准与待评价试验均未实施盲法，此两方面也可能为异质性的主要来源。

四、SAT-TB的检测优点及假阴性、假阳性结果分析

SAT-TB法不仅具有高敏感度和高特异度的优点，由于该技术以MTB的RNA进行检测，RNA在MTB死亡后可很快降解，该技术可更准确、更快速鉴别患者痰标本MTB为死菌还是活菌。因此，该技术可以作为抗结核药物治疗疗效评价的指标。van der Vliet等[24]在肺结核患者服用利福平和氧氟沙星治疗的第3天和第7天分别检测DNA和RNA，发现RNA的量明显下降，提示RNA检测可用于疗效监测。

目前，SAT-TB技术可认为是一种快速诊断肺结核的方法，9篇文献中均存在一定的假阳性和假阴性结果。假阳性的原因可能系不同研究在实际操作中存在标本之间的交叉污染，由于所有研究均没有交待检测患者处于治疗的何种阶段，因此假阴性的原因不排除因治疗后系死菌所致的可能，当然，也可能由于痰涂片法受标本取材、患者自身间断排痰及标本菌量等影响，敏感度较低[25-26]。培养法虽是结核病诊断的金标准，尽管改进后的BACTEC快速培养系统使培养时间缩短至15 d左右，但与SAT-TB比较，其耗时仍较长，不能满足临床快速诊断的需要[27]。文献检索发现，SAT-TB对检测肺泡灌洗液在肺结核诊断上具有较好的价值，范琳等[23]用SAT-TB技术检测234例涂阴疑似肺结核患者的肺泡灌洗液，敏感度和特异度同样高达81.0%和96.9%，提示此技术在检测肺泡灌洗液诊断肺结核上仍然具有较大潜力。但由于类似的研究报道较少，本研究未纳入支气管灌洗液标本作为Meta分析的资料。对于肺外结核的诊断，成松等[28]用SAT-TB技术检测90例确诊结核性胸膜炎患者的胸腔积液，敏感度较高，达90.9%；但特异度较低，仅为72.1%；可能与临床对照组患者的选择有关。关于肺外结核的SAT-TB法诊断价值的研究仍然较少，尚待进一步研究。

[1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2016.Geneva:World Health Organization,2016.

[2] Anochie PI,Onyeneke EC,Ogu AC,et al.Recent advances in the diagnosis ofMycobacteriumtuberculosis．Germs，2012，2(3):110-120．

[3] Palomino JC．Current developments and future perspectives for TB diagnostics．Future Microbiol，2012，7(1):59-71．

[4] 欧喜超，夏辉，李强，等．快速核酸提取环介导等温扩增检测技术在肺结核诊断中的应用评价．中国防痨杂志，2016，38(5)：393-397．

[5] 王永忠，柳龙根，张宏宇，等．结核分枝杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测方法的建立及应用．江苏医药，2011,37(23)：2820-2822.

[6] 白广红，朱蕾，高漫．7种实验方法诊断结核病的临床应用价值．临床荟萃，2014，29(6)：608-610.

[7] 张立群，刘一典，朱友生，等.我国结核病临床诊断的回顾与展望.中国防痨杂志，2014,36(9)：769-773.

[8] Whiting P,Rutjes AW,Westwood ME,et al.QUADAS-2：a revised tool for the quality assessment of diagnostic accuracy studies.Ann Intern Med,2011,155(8):529-536.

[9] 崔振玲，沙巍，黄晓辰，等.RNA恒温扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的研究.中华结核和呼吸杂志,2011,34(12):894-897.

[10] Cui Z, Wang Y, Fang L,et al.Novel real-time simultaneous amplification and testing method to accurately and rapidly detectMycobacteriumtuberculosiscomplex. J Clin Microbiol,2012,50(3):646-650.

[11] 倪丽丽,罗柳林,景玲杰,等.恒温扩增实时荧光检测技术在肺结核诊断中的临床价值.中国检验医学杂志,2012,35(8):702-705.

[12] 蔡杏珊,马品云,张院良,等.实时荧光核酸恒温扩增检测技术在结核病诊断中的临床应用.中国防痨杂志，2014，36(6)：458-461.

[13] 许光辉,赵柳婵,陈华,等.实时荧光核酸恒温扩增技术在肺结核诊断中的价值分析.临床肺科杂志，2015,20(8):1487-1489.

[14] 张慧慧,熊国亮.SAT技术检测肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌的临床应用研究.实验与检验医学,2015,33(4):407-409.

[15] 葛燕萍,张青.痰标本RNA恒温扩增技术对活动性肺结核的临床诊断价值.中国防痨杂志，2016,38(9):742-746.

[16] Yan L,Tang S,Yang Y,et al.A large cohort study on the clinical value of simultaneous amplification and testing for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Medicine, 2016,95(4):1-5.

[17] 王亚娟，冯萍，熊礼宽．分枝杆菌鉴定的分子生物学方法研究进展．临床肺科杂志,2009,14(3):353-355.

[18] 欧喜超，夏辉，李强，等.快速核酸提取环介导等温扩增检测技术在肺结核诊断中的应用评价.中国防痨杂志，2016，38(5)：393-397.

[19] 于霞，梁倩，马异峰，等.环介导等温扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的初步评价.中国实验诊断学，2013，17(5)：846-849.

[20] Moussa HSh,Bayoumi FS,Ali AM.Evaluation of GeneXpert MTB/RIF assay for directdiagnosis of pulmonary tuberculosis.Saudi Med J,2016,37(10):1076-1081.

[21] Yan L,Xiao H,Zhang Q.Systematic reviw:comparison of Xpert MTB/RIF,LAMP and SAT methods for the diagnosis of pulmonary tuberculosis.Tuberculosis(Edinb),2016,96:75-86.

[22] Fan L,Zhang Q,Cheng L,et al.Clinical diagnostic performance of the simultaneous amplification and testing methods for detection of theMycobacteriumtuberculosiscomplex for smear-negative or sputum-scarce pulmonary tuberculosis in China.Chin Med J(Engl),2014,127(10):1863-1867.

[23] 范琳，王鹏，杨妍，等. RNA恒温扩增实时荧光检测技术检测支气管肺泡灌洗液对涂阴肺结核的快速诊断价值. 中国防痨杂志，2015,37(2)：140-144.

[24] van der Vliet GM,Schepers P,Schukkink RA,et al. Assessment of mycobacterial viability by RNA amplification.Antimicrob Agents Chemother,1994,38(9)：1959-1965.

[25] 李虹泽，项杰．荧光镜检法和萋-尼氏抗酸染色法检测1000例结核患者痰样本的结果分析．临床肺科杂志，2010,15(1):126-127.

[26] 朱玉兰，王佃鹏，高朝贤，等．结核分支杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用.中国热带医学，2008,8(10):1680-1682.

[27] 张涛，吕纯芳，卢留珠，等．BACTEC MGIT960系统快速培养分枝杆菌的效果评价．临床肺科杂志，2011,16(5):521-522.

[28] 成松,刘成永，周冬青，等.实时荧光核酸恒温扩增检测技术在胸腔积液结核分枝杆菌检测中的应用.国际检验医学杂志,2015,36(18):2697-2701.

(本文编辑：范永德)

The diagnostic value of SAT-TB for detection sputum in patients with pulmonary tuberculosis: a Meta-analysis

SUNBao-bin,XIEMing-juan,CHENXiao-you.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

CHENXiao-you,Email:chenxy1998@hotmail.com

Objective To evaluate the rapid diagnostic value of simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis(SAT-TB) from sputum in patients with pulmonary tuberculosis. Methods All studies involved the diagnostic value of SAT-TB for detectionMycobacteriumtuberculosisRNA from sputum samples for pulmonary tuberculosis were searched in CNKI,Wanfang,VIP,PubMed,ScienceDirect and Cochrane Library databases from establishment to December 2016. The inclusion and exclusion criteria for screening literatures was formulated. Two researchers independently fetched the data from articles and assessed their quality. Meta-DiSc (version 1.4) was used for Meta-analysis. Results The literatures search resulted in 168 abstracts identified and 9 studies with full text were recruited for analysis including 5137 sputa samples from patients with pulmonary tuberculosis according to the inclusion and exclusion criteria, and all samples were detectedMycobacteriumtuberculosisRNA by SAT-TB and MTB by culture. The quality of 9 studies was assessed with QUADAS-2 and the main bias risk was case selection. In all studies, the pooled sensitivity, pooled specificity, positive likelihood ratio and negative likelihood ratio of SAT-TB were 87.0% (95%CI:86.0%-89.0%), 90.0% (95%CI:88.0%-91.0%),6.91 (95%CI:4.04-11.84) and 0.09 (95%CI:0.06-0.15), respectively. Conclusion The rapid diagnostic value of SAT-TB forMycobacteriumtuberculosisRNA from sputum samples for pulmonary tuberculosis is very high with high sensitivity and specificity. SAT-TB is worth for clinical application in the future.

Tuberculosis,pulmonary; Diagnostic techniques and procedures; Nucleic acid amplification techniques; Meta-analysis as topic

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.05.019

北京市医院管理局“登峰”计划专项(DFL20151501)；北京市高层次卫生技术人员培养项目(2014-3-083)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院

陈效友，Email: chenxy1998@hotmail.com

2017-02-06)