KIR-HLA基因多态性与散发性急性戊型肝炎的关系

陈 冲， 章树业， 荀静娜， 张玉玲， 李微霞， 卢 川， 陈 良

(1 温州医科大学， 浙江 温州 325000； 2 复旦大学附属上海市公共卫生临床中心， 上海 201508)

KIR-HLA基因多态性与散发性急性戊型肝炎的关系

陈 冲1,2， 章树业2， 荀静娜2， 张玉玲2， 李微霞2， 卢 川2， 陈 良1,2

(1 温州医科大学， 浙江 温州 325000； 2 复旦大学附属上海市公共卫生临床中心， 上海 201508)

目的 探讨杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)及其配体人类白细胞抗原(HLA)的基因多态性与散发性急性戊型肝炎(AHE)的相关性。方法 收集2015年8月-2016年9月期间于复旦大学附属公共卫生临床中心肝炎一科住院的AHE患者42例，另招募健康受试者30例作为对照组。提取入组对象外周血基因组DNA，采用序列特异性引物PCR法扩增KIR基因，并利用Sanger测序法对HLA进行基因分型，分析KIR-HLA分布与散发性AHE的关系。计数资料组间比较采用χ2检验。结果 两组均可检测到16种KIR基因(包括抑制型受体基因2DL1-3、2DL5、3DL1-3，激活型受体基因2DS1-5、3DS1，较特殊的抑制型/激活型受体基因2DL4，内参基因DRB1及假基因2DP1)，同时HLA-B(包括HLA-Bw4、HLA-Bw6、HLA-Bw4/Bw6)、HLA-C(包括HLA-C1/C1、HLA-C1/C2、HLA-C2/C2)亦可检测。AHE患者中抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3出现的频率显著低于对照组(64.3% vs 93.3%,P<0.05; 23.8% vs 56.7%,P<0.05; 71.4% vs 100%,P<0.05; 69.0% vs 100%,P<0.05)；AHE患者HLA-C1/C2和3DL1/HLA-Bw4基因的出现频率低于对照组(19.0% vs 40.0%,P<0.05；45.2% vs 73.3%,P<0.05)；另外，AHE患者中HLA-C1/C1基因出现的频率高于对照组(71.4% vs 46.7%,P<0.05)。结论 抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3，HLA-C1/C1、C1/C2和3DL1/HLA-Bw4的基因分布差异可能与HEV感染导致散发性AHE有一定关系。

肝炎, 戊型； 多态性, 单核苷酸； 受体, 自然杀伤细胞； HLA抗原； 基因型

急性戊型肝炎(acute hepatitis E，AHE)是由HEV感染引起的急性自限性疾病，主要通过被污染的水和食物经消化道传播。全球既往HEV感染率为8%～20%[1-2]，但感染发病群体仅占既往感染者非常小的一部分，大多数HEV感染者并未表现出急性肝炎症状[3]，其自身机体是否存在某些免疫学特征导致急性肝炎的发生有待进一步研究。

自然杀伤细胞(NK细胞)为天然免疫系统的关键组成部分，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞，其可产生细胞因子和发挥细胞毒性作用，在感染的早期控制病毒使其感染局限，亦可介导获得性免疫反应[4]。NK细胞的激活是一个复杂的平衡过程，有赖于细胞表面激活与抑制相关受体之间相互调节，杀伤性免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptors,KIR)作为NK细胞主要受体之一，在参与调节NK细胞功能方面起着非常重要的作用，与KIR结合的配体主要是人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，多种抑制型和活化型KIR与HLA结合，传递抑制或激活信号，调节NK细胞的活性[5]。近年来KIR基因多态性与病毒感染免疫相关的报道日益增多，包括HIV、HBV、HCV、EB病毒等[6]，然而HEV与KIR-HLA基因多态性的研究则较少报道，本研究旨在探讨KIR-HLA基因多态性与散发性AHE的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2015年8月-2016年9月于复旦大学附属公共卫生临床中心肝炎一科住院的AHE患者42例，其中男31例，女11例，年龄24～49岁，平均32岁。诊断标准：肝酶升高，血清胆红素升高以及ELISA测定抗-HEV IgM阳性。另招募健康志愿者30例，其中男21例，女9例，年龄25～43岁，平均30岁。本研究患者及健康志愿者均签署知情同意书。

1.2 样本采集 留取AHE患者及健康志愿者静脉血5 ml，于-80 ℃保存待测。

1.3 主要试剂和仪器 血液基因组DNA小量提取试剂盒(DK601，上海莱枫生物科技有限公司)，PCR扩增仪(DYQ6072，杭州博日科技有限公司)，水平电泳仪(DYY-6D型，北京六一生物科技有限公司)，紫外/凝胶成像系统(NJ-206，上海驰唐仪器)，3730XL自动测序仪(Applied Biosystems, 美国)。

1.4 检测方法

1.4.1 外周血基因组DNA提取 血液样本在室温25 ℃解冻，采用细胞裂解法从全血中快速提取样本的基因组DNA。

1.4.2 KIR基因分型 采用序列特异性引物PCR法扩增目的片段。特异性引物设计参考文献[7](引物由苏州金唯智公司合成)，PCR试剂盒(TaKaRa公司)程序设置：94 ℃ 3 min；5个循环：94 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；21个循环：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；4个循环：94 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；72 ℃ 7 min。扩增后产物经由3%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外/凝胶成像系统扫描成像，根据条带结果判定相应的基因。KIR的AA或Bx单倍体判别在http://www.allelefrequencies.net/kir6001a/asp中进行比对。

1.4.3 HLA基因分型 3730XL自动测序仪分析HLA基因分型，将特定的荧光标记在引物上配制反应Mix，并设置阴性对照，通过PCR产物的长度大小检测基因。HLA-B和C型单倍体的确定在SBTengine 3.10.0.2610软件中分析得到。比较两组KIR基因位点的基因频率有无差异，KIR基因表型频率的计算采用阳性频数计算法。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行数据分析。计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组KIR及HLA基因分型频率 两组均可检测到16种KIR基因(包括抑制型受体基因2DL1-3、2DL5、3DL1-3，激活型受体基因2DS1-5、3DS1，较特殊的抑制型/激活型受体基因2DL4，内参基因DRB1及假基因2DP1)(表1)，同时HLA-B(包括HLA-Bw4、HLA-Bw6、HLA-Bw4/Bw6)、HLA-C(包括HLA-C1/C1、HLA-C1/C2、HLA-C2/C2)亦可检测(表2)。健康志愿者的假基因2DP1以及大部分基因片段2DL1/2DL3/2DL5/3DL1/3DL2/3DL3/2DS1/2DS2/2DS3/2DS4/2DS5/3DS1与我国人群KIR相关分型频率相对一致，但部分基因的出现频率如2DL2/2DL4存在较大范围的偏离。AHE患者中抑制型基因KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3出现的频率显著低于健康对照组(64.3% vs 93.3%,P<0.05; 23.8% vs 56.7%,P<0.05; 71.4% vs 100%,P<0.05; 69.0% vs 100%,P<0.05)(表1)。

2.2 AHE与健康对照组KIR-HLA配体组合比较 AHE患者HLA-C1/C1基因出现频率高于健康对照组(P=0.034)；HLA-C1/C2和3DL1/HLA-Bw4基因出现频率低于健康对照组(P值分别为0.031、0.018)。其余KIR基因位点基因及配体结合频率差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

表1 两组KIR基因表达频率比较[例(%)]

注：OR，比值比；95%CI，95%可信区间

3 讨论

NK细胞的生物学效应受多种激活型与抑制型受体调控，表面受体KIR及其配体HLA的相互作用在调控NK细胞抵抗病毒感染的免疫功能上起着至关重要的作用[5-6]。HLA是人类主要组织相容性复合体 Ⅰ 类分子，其最著名的功能是递呈胞内小肽给CD8+T淋巴细胞，而另一个作用则是作为KIR识别的受体。由于KIR基因的数量变异、序列多样性、体内表达多样以及KIR-HLA结合多态性，使得KIR-HLA系统复杂多变[8]，均可能影响HEV感染机体时的免疫反应。

本研究中KIR-HLA基因分析结果显示，HLA-C1/C1与HLA-C1/C2在AHE患者中出现的频率高于健康对照组，提示高表达的HLA-C可能与散发性AHE有一定关系。已有研究[9]表明，HLA-C基因的高表达有利于机体控制HIV感染，通过提高特异性T淋巴细胞对HIV的应答来减缓获得性免疫缺陷综合症患者的病程进展，尤其是HLA-C1/C1与KIR 2DL3存在时，NK细胞分泌的干扰素会显著增多，使机体抵抗病毒感染的能力增强。不仅如此，Khakoo等[10]对HCV感染者KIR-HLA基因组合进行分析，发现KIR 2DL3/HLA-C1基因组合有利于病毒的清除。以上研究的对象为HIV、HCV感染者，鉴于NK细胞在多种感染性疾病、肿瘤及自身免疫性疾病发病及进展等方面均有重要作用且机制复杂，所以即使在同一种族人群不同疾病背景的受试者中进行KIR-HLA分型也可能存在一定程度的差异。另外，本研究中AHE组的KIR 2DL3出现频率显著低于健康对照组，2DL3/HLA-C1的组合频率低于健康对照组，尽管差异无显著性，但仍具有一定的提示作用。既往已有研究[11]报道随机人群KIR 2DL3阳性的NK细胞在抵御各种病毒感染的早期能够分泌更多的干扰素γ，表现出更强的细胞脱颗粒作用，对感染的肝细胞具有直接的杀伤作用。

KIR 3DL1/HLA-B是最早被发现的具有高度多变性的受体-配体基因型，虽然既往报道[12]提示二者出现在全球人群的频率接近100%，但随着人类的进化，其演变出的基因亚型非常多。其中KIR 3DL1/HLA-Bw4不同亚型的特异性结合，不仅可表现出不同的受体-配体结合亲和性，而且在机体应对感染功能方面存在差异。Boudreau等[13]的研究揭示了KIR 3DL1/HLA-Bw4基因表达的密度与结合力不同可以调节NK细胞抵抗HIV感染，证实其是HIV感染的保护性因素。本研究结果显示，KIR 3DL1/HLA-Bw4在AHE组中的出现频率较健康对照组低，提示若宿主为KIR 3DL1/HLA-Bw4基因型的表达者，AHE的患病几率可有所减低。

本研究中AHE组KIR 2DL3/2DL5/3DL2/3DL3的频率显著低于对照组，KIR 2DL5基因编码的胞浆区域可通过聚集Src同源区域编码的酪氨酸磷酸酶来抑制NK细胞的活性[14]，但其与机体病毒感染的具体效应机制未见明确报道。虽已有研究[15]报道3DL2/3DL3异常频率在强直性脊髓炎的慢性炎症中充当一定的角色，但相关的病毒感染方面的报道并不多见，因此研究具有不同遗传背景及不同临床表型的HEV感染病例，可能会有新的发现。

值得注意的是，部分基因如2DL2/2DL4在本研究中的出现频率有一定范围的偏离，考虑到纳入研究的队列仅72例，可能是由于样本量不足导致部分结果的偏差。一方面由于复旦大学附属公共卫生临床中心是一家传染病专科医疗机构，该中心有3个肝病病区，未能将中心所有HEV感染者均纳入研究；另一方面上海市是医疗卫生相对发达的城市，人群受不洁饮食感染的机会较其他地区小。但总体来说，笔者对KIR-HLA进行了比较全面的分析，采取目前国内外广泛应用的PCR-SSP基因分型方法，实验设计较为完整，排除了年龄及性别等混杂因素的干扰，得到相对客观的实验结果，揭示了散发性AHE与NK细胞KIR-HLA分型确实存在一定联系。此外，本研究仅在宿主免疫非常小的一方面进行了研究分析，事实上KIR-HLA具有高度多态性，在不同地区、不同人种中的分布具有很大的差异，而且除KIR外，还有多种细胞表面抑制型、活化型受体及细胞因子参与噬肝病毒感染时NK细胞的免疫调节功能。例如，在慢性乙型肝炎中，IL-10即发挥负性调控NK细胞功能的作用，影响NK细胞的抗病毒能力[16]。因此，进一步多地区、大样本及深层的免疫学研究了解NK细胞调节HEV感染的机制是非常必要的，这也将会为HEV感染的预防和治疗提供相应的免疫学依据。

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引证本文：CHEN C, ZHANG SY, XUN JN, et al. Association between killer cell immunoglobulin-like receptor/human leukocyte antigen gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis E[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(3): 462-465. (in Chinese)

陈冲， 章树业， 荀静娜， 等. KIR-HLA基因多态性与散发性急性戊型肝炎的关系[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(3): 462-465.

(本文编辑：王 莹)

Association between killer cell immunoglobulin-like receptor/human leukocyte antigen gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis E

CHENChong,ZHANGShuye,XUNJingna,etal.

(WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou,Zhejiang325000,China)

Objective To investigate the association between killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR)/human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphisms and sporadic acute hepatitis E (AHE). Methods A total of 42 AHE patients who were hospitalized in First Department of Hepatitis, Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, from August 2015 to September 2016 were enrolled, and 30 healthy subjects were enrolled as control group. Genomic DNA was extracted from the peripheral blood, and PCR/sequence specific primer was used for the amplification of KIR gene. Sanger sequencing was used to determine the genotype of HLA, and the association between KIR-HLA distribution and sporadic AHE was analyzed. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. Results A total of 16 KIR genes were detected in each group, including inhibitory receptor genes 2DL1-3, 2DL5, and 3DL1-3, activating receptor genes 2DS1-5 and 3DS1, the special inhibitory/activating receptor gene 2DL4, internal reference gene DRB1, and pseudogene 2DP1, as well as HLA-B (including HLA-Bw4, HLA-Bw6, and HLA-Bw4/Bw6) and HLA-C (including HLA-C1/C1, HLA-C1/C2, and HLA-C2/C2), were also detected. Compared with the control group, the AHE group had significantly lower frequencies of inhibitory genes KIR 2DL3 (64.3% vs 93.3%,P<0.05), 2DL5 (23.8% vs 56.7%,P<0.05), 3DL2 (71.4% vs 100%,P<0.05), and 3DL3 (69.0% vs 100%,P<0.05), significantly lower frequencies of HLA-C1C2 (19.0% vs 40.0%,P<0.05) and 3DL1/HLA-Bw4 (45.2% vs 73.3%,P<0.05), and a significantly higher frequency of HLA-C1/C1 gene (71.4% vs 46.7%,P<0.05). Conclusion The difference in the distribution of inhibitory genes KIR 2DL3, 2DL5, 3DL2, and 3DL3, HLA-C1C1/C1C2, and 3DL1/HLA-Bw4 may be associated with sporadic AHE caused by hepatitis E virus infection.

hepatitis E； polymorphism, single nucleotide; receptors, natural killer cell； HLA antigens； genotype

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.013

2016-10-17；

2016-11-09。

国家重点基础研究发展计划“973计划”(2015CB554303)；上海申康医院发展中心市级医院新兴前沿技术联合攻关项目(SHDC12015129)；上海市科委“科技创新行动计划”医学与农业领域重点项目(13401902100)

陈冲(1991-)，女，主要从事感染内科及病毒学方面的研究。

陈良，电子信箱:chenliang@shaphc.org。

R512.6

A

1001-5256(2017)03-0462-04