肝窦内皮细胞在肝纤维化发生发展中的机制及相关治疗策略

杜艳芹， 吴 珺， 杨东亮

(华中科技大学同济医学院附属协和医院 感染科， 武汉 430022)

肝窦内皮细胞在肝纤维化发生发展中的机制及相关治疗策略

杜艳芹， 吴 珺， 杨东亮

(华中科技大学同济医学院附属协和医院 感染科， 武汉 430022)

肝窦内皮细胞不仅是保护肝脏免受损伤的第一道防线，也在慢性肝损伤导致的纤维化和肝硬化中伴有重要角色。它主要通过介导肝脏炎症反应、参与肝窦毛细血管化和血管再生、激活肝星状细胞、分泌多种促炎细胞因子、参与细胞外基质生成以及介导肝脏微循环障碍等参与肝纤维化。阐明这些机制，有助于探索肝纤维化治疗的新靶点和方案。

肝硬化； 肝窦内皮细胞； 治疗

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)构成了肝血窦的血管壁，是肝内非实质细胞的主要群体，约占肝非实质细胞的50%。已分化的LSEC电镜下可见其特征性的窗孔结构，且窗孔内皮下缺乏完整的基膜，窗孔占据总表面积的6%～8%[1]，这种多孔性结构在肝实质细胞与血液物质交换中起着关键的作用。LSEC的另一个结构特点是胞质内含有大量的吞饮小泡，参与多种内源性和外源性颗粒及大分子物质的内吞摄取。LSEC也表达多种清道夫受体，参与大颗粒物质的清除，在Kupffer细胞缺乏或耗尽时，LSEC可直接吞噬并清除较大的颗粒。LSEC还具有合成Ⅳ型胶原及各种非胶原基质如纤维结合蛋白(FN)和层黏连蛋白(LN)的功能。此外，LSEC在肝内的免疫调节中也具有重要的作用。LSEC表达多种模式识别受体[2]，能识别并清除病原相关分子模式和宿主自身的损伤相关分子模式，参与天然免疫应答。LSEC还表达FcγRⅡb2，结合在IgG的Fc段，其在清除血液中的抗原与 IgG形成的小免疫复合物上具有重要作用。另外，LSEC组成性表达与专职抗原递呈细胞相关的一系列表面分子，如主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子和MHC-Ⅱ类分子，CD54(ICAM), CD106(VCAM-1)和共刺激分子CD80、CD86和CD40[3]，可以通过抗原递呈方式活化T、B淋巴细胞。在生理状态下，LSEC通过一系列途径如诱导调节性T淋巴细胞的分化、共抑制分子B7H1的高表达等维持肝内的免疫耐受。

由于其特殊的解剖位置，LSEC是保护肝脏免受损伤的第一道防线[4]，门静脉系统带来的、肠道吸收的各种物质首先作用于LSEC。LSEC持续的损伤和炎症反应，通过一些机制导致肝星状细胞(HSC)的激活、细胞外基质(ECM)生成和降解失衡等，促进肝纤维化的发生发展。本文简要介绍LSEC在肝纤维化中发生发展的机制及其相关的可能治疗策略。

1 LSEC参与肝纤维化形成

肝纤维化是肝内ECM成分过度沉积的一种伤口愈合反应。当肝损伤和炎症持续存在时，肝脏不能正常再生并形成纤维性瘢痕，重者导致肝小叶结构重构、假小叶及结节形成，即肝硬化。在引起肝硬化的各种慢性肝病中，酒精性肝病和非酒精性脂肪肝为西方国家最常见的病因，而亚太地区最常见的肝硬化原因是病毒性肝炎，主要是乙型肝炎[5]。此外，其他许多疾病如药物性肝损伤、自身免疫性肝病、遗传性疾病如威尔逊病等也可导致肝纤维化。LSEC以多种机制参与肝内纤维化的形成。

1.1 LSEC表型变化并介导肝脏炎症反应 研究[6]表明，正常和活化的LSEC均未见CD31、CD34、FVⅢ-RAg、E-选择素和钙黏蛋白5等常见的血管内皮表面标志物，但特异性表达CD4、CD14、CD32(FcⅡR)、CD44[透明质酸(HA)的受体]等。LSEC正常表型的维持需要旁分泌和自分泌作用以及ECM的支持。而在肝纤维化小鼠模型中[7]，LSEC的表型发生变化，CD31和CD105高表达，而MHC-Ⅱ类分子、CD40、CD86、CD11b以及CD44表达相对低下。LSEC表面CD44表达减少，其清除HA的功能下降，导致ECM增多。黄月红等[8]在CCl4诱导的肝硬化大鼠模型中发现肝窦CD31表达增强。王宪波等[9]也在二甲基亚硝胺诱导大鼠肝硬化模型中发现，造模成功后大鼠体内HA明显升高，而LSEC表面CD44和 Ⅷ 因子相关抗原的表达下降。更重要的是，发生肝纤维化时，LSEC免疫功能也从免疫耐受状态转变为免疫应答状态[7]，其通过产生一系列的促炎调节介质如TNFα、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、MCP-1、RANTES等，高效捕获抗原诱导抗原特异性T淋巴细胞增殖、活化，同时抑制调节性T淋巴细胞的生成。而持续性的炎症反应进一步促进了肝纤维化的进展。此外，在慢性乙型肝炎肝纤维化中，LSEC表达的ICAM-Ⅰ增强与肝纤维化严重程度相关，其可以促进细胞毒性T淋巴细胞经肝窦状内皮间隙从血流向靶细胞移动，促进炎症和免疫反应[10]。

1.2 肝窦毛细血管化和血管生成 已分化的LSEC具有特征性的窗孔结构，且窗孔内皮下缺乏完整的基膜。影响窗孔大小和数目的因素很多，如压力、药物、毒物、性激素、乙醇、5-羟色胺、尼古丁等[1,11]。来源于肝细胞和HSC的血管内皮生长因子(VEGF)是调节LSEC表型的重要分子,VEGF以2种途径即NO-依赖途径和非NO-依赖途径维持LSEC的窗孔表型[12]。在各种病因如酒精性肝损伤、非酒精性脂肪肝、中毒性肝损伤和胃内酒精输灌模型进展为肝纤维化之前，都观察到LSEC独特的窗孔消失[12]，因此LSEC窗孔变化先于肝纤维化。陆雄等[13]在二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝硬化模型中，也发现LSEC窗孔的改变早于肝细胞坏死、内皮下基底膜形成、肝结构改变及肝纤维化形成。在肝硬化肝脏中，经常发现窦内皮细胞失窗孔及内皮下基底膜的出现[14]，类似于毛细血管，因而这两种结构的变化又称为肝窦毛细血管化。我国学者在多种肝纤维化动物模型如CCl4诱导大鼠肝纤维化模型[8]、大鼠酒精性肝硬化模型[15]及家兔非酒精性肝硬化模型[16]等，也都发现了窦内皮细胞失窗孔及内皮下基底膜的出现。大量的证据也表明了肝硬化中存在肝内窦状毛细血管的重建，而LSEC上的CD31、CD34、 Ⅷ 相关抗原等常见的血管内皮细胞标志物的出现，也提示了肝纤维化时LSEC向毛细血管转化。窗孔消失使得内皮增厚和过量ECM在Disse间隙的内皮下沉积，而ECM的沉积又使LSEC的窗孔数量大大缩小甚至完全消失，使得肝窦压力和血流阻力增加，进一步阻碍许多底物通过Disse间隙从肝窦转移入肝细胞[17]，导致肝脏微循环障碍，进一步促进了纤维化的进展，造成恶性循环。

肝窦血流受影响后，造成低氧环境，进一步诱导LSEC和HSC上的低氧诱导因子表达，从而活化转录因子如VEGF，直接或间接地促进血管生成[18]。VEGF与内皮前体细胞例如成血管细胞和分化或成熟的LSEC相互作用。另外，也有证据表明促炎因子TNFα、IL-6和NO等直接促进血管生成[18]。刺激后内皮细胞分泌几种纤溶酶原激活物和基质金属蛋白酶(MMP)，这些分子降解亲本血管的ECM和血管基底膜，使新产生的内皮细胞侵入周围基质[19]。而缺氧加速了内皮细胞的增生并形成固体内皮管，同时，由于有丝分裂剂的作用，发生了内皮细胞的DNA合成和分裂，内皮细胞和周细胞合成基底膜并形成管腔[19]，周细胞穿透到管腔的节段中心并构成新毛细血管的结构。最后，血管稳定生成，并且LSEC分泌生长因子例如血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)，其吸引支持细胞以稳定新血管。新血管可以通过将炎症细胞运输到损伤部位，并通过向再生的成熟组织提供营养物和氧气来维持慢性炎症[18]。

1.3 损伤的LSEC激活HSC HSC位于Disse间隙，紧邻肝细胞和LSEC，其约占肝脏非实质细胞的5%～15%。静止状态下的HSC通常很小，细胞质含有维生素A脂滴，在致病因素的持续刺激下，通过复杂的机制激活HSC，使其表型发生变化，转变为大而平坦的肌成纤维细胞[20]。活化的HSC失去储存脂质颗粒的能力，转而具有分泌大量ECM和多种促炎、促纤维化细胞因子的功能，以及增加了PDGF受体和平滑肌肌动蛋白α的表达。而且一旦被激活，HSC的激活作用就会通过很多自分泌系统的作用而自行延续下去[21]，如其表达平滑肌肌动蛋白α与肌成纤维细胞的激活直接相关。目前普遍认为HSC的活化和增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。

生理状态下，已分化具有窗孔的LSEC使HSC保持静默状态。DeLeve等[22]证明LSEC产生的NO维持了HSC的静默状态，而用阻断剂阻断LSEC内皮NO合酶(endothelial NO synthase,eNOS)后，HSC发生了活化，但是NO不能逆转活化的HSC回到静默状态。DeLeve[12]进一步通过体内外实验证明，已分化具有窗孔的LSEC，通过旁分泌因子使活化HSC沉默，从而抑制肝纤维化进程甚至逆转该过程；而体外实验中毛细血管化的LSEC与HSC共培养，HSC有明显的活化现象，因此毛细血管化的LSEC促进了HSC的活化。

病理状态下，LSEC还可以通过多种途径直接或间接地激活HSC。首先，肝损伤早期，LSEC可分泌细胞型FN，其对HSC具有激活作用。在肝纤维病变中，LSEC分泌的FN急剧升高，从而改变了局部ECM的性状，导致ECM沉积，使静息状态的HSC转变成肌成纤维细胞[23]；此外，FN还能抑制HSC的凋亡。其次，在胆管结扎的肝硬化模型中，损伤的LSEC合成的纤连蛋白-EⅢA增加，进而促进了HSC活化，但最近研究[12]表明纤连蛋白-EⅢA在HSC活化中并不是关键因素，而只是促进了HSC的运动。更重要的是，肝损伤中LSEC分泌内皮素(endothelin, ET)，主要是ET-1，其与HSC上的内皮素A受体(ETRA)和内皮素B2受体(ETRB2)结合从而活化HSC并促进HSC自分泌ET。ET-1不仅诱导HSC增殖和收缩，还诱导肝窦性血管收缩，而且增加ECM合成[24]，启动肝纤维化的发生发展。另外一些研究[25-26]表明，LSEC能分泌IL-33、TGFβ、PDGF等活化HSC，促进肝纤维化发展。最后，当肝窦毛细血管化时，因血氧弥散障碍，可致HSC缺氧，缺氧可致HSC迅速活化，同时毛细血管化的LSEC阻碍肝细胞与血液之间的物质交换，导致肝细胞损伤或者凋亡，致使正常的肝细胞膜对 HSC增殖的接触性抑制作用丧失，而间接激活HSC[27]。

1.4 促炎细胞因子和信号通路 肝纤维化也是由复杂的细胞因子网络来调控。慢性损伤导致LSEC窗孔消失，基底膜出现和表型转换，使其转变为毛细血管化的LSEC，伴随着可溶性因子产生和释放并迅速传播到相邻细胞，影响其表型[28]。在众多的细胞因子中，PDGF和TGFβ的作用最为突出。PDGF是所有多肽促生长因子中对HSC最强的促分裂原[5]，一旦与HSC细胞膜上的受体结合，活化相应的信号通路和转录因子，可导致下游的靶基因活化和HSC的活化。其中PDGF-D激活HSC发挥促有丝分裂和促纤维化作用，在肝纤维化基质重塑中具有重要作用[29]。TGFβ是已知的最强的促肝纤维化诱导剂[5]，损伤的LSEC分泌TGFβ1增多，TGFβ1的主要作用是刺激HSC活化，并且活化的HSC自分泌TGFβ1作用于自身和LSEC,该循环对肝纤维化进展形成重要的正反馈[30]。Cui等[31]研究表明，TGFβ1还诱导基质产生基因的表达，并且通过下调MMP和促进金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)来抑制ECM的降解，导致胶原纤维过度沉积、促进肝纤维化的发展。此外，LSEC分泌TGFβ1，与肝细胞膜上的受体结合，介导肝细胞凋亡，并抑制间质细胞分泌肝细胞生长因子以及抑制肝细胞生长因子对肝细胞有丝分裂的促进作用，间接抑制肝细胞的分裂和增殖，从而促进了肝纤维化发展[32]。

另外，慢性损伤导致LSEC中成纤维生长因子受体1持续活化，其干扰肝损伤修复的趋化因子CXC亚家族受体7-Id1途径并且有利于趋化因子CXC亚家族受体4驱动的促纤维化血管生成反应，从而引起肝纤维化[33]。肝硬化中常常伴有肠源性内毒血症，因此作为最先暴露于门静脉脂多糖的LSEC，可通过Toll样受体(TLR)4/MyD88信号转导途径经不同的机制参与肝纤维化发生[34]。静息状态下的HSC高表达BAMBI，它是一种内源性TGFβ的抑制剂。而TLR4下调BAMBI使HSC对TGFβ诱导的信号敏感[35]，促进了HSC的活化。TLR4信号还促进HSC产生FN, HSC衍生的FN诱导LSEC的迁移和血管生成，促进肝纤维化[35]。另外，TLR4激活还上调如Kupffer细胞和HSC等细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子的表型。活化的HSC进一步产生大量ECM参与肝纤维化的形成。

1.5 ECM的生成和降解失衡 ECM包括胶原和非胶原糖蛋白、蛋白多糖和弹性蛋白等，他们构成间质细胞的基质即上皮细胞和血管的基底膜。活化的HSC合成胶原的能力极强，约为LSEC的20倍，但主要合成Ⅰ型胶原，而LSEC主要合成Ⅳ型胶原。黄月红等[8]在CCl4诱导大鼠肝硬化模型中发现早期Disse间隙Ⅳ型胶原沉积，随着CCl4损伤的加重，肝窦内皮下出现连续的基膜伴随Ⅳ型胶原沉积和LN持续增多，进而推测Ⅳ型胶原和LN沉积共同构成连续的基底膜。Disse间隙Ⅳ胶原沉积，这一病理变化也启动了参与肝纤维化的各种因子，继而导致Ⅰ和 Ⅲ 胶原的进一步沉积。另外，损伤早期，LSEC可分泌细胞型FN，其对HSC具有激活作用。在肝纤维病变中，LSEC分泌的FN急剧升高，从而改变了局部ECM的性状，导致了ECM的沉积，同时使静息状态的HSC转变成肌成纤维细胞，进一步促进了ECM的产生[27]。肝脏内过量胶原形成及沉着以及ECM局部重建和重分布[32]，导致ECM合成和降解失衡，使其在肝脏中过多积聚和沉积，特别是后期的降解减少是肝纤维化形成的主要机制之一。ECM沉积于Disse间隙，导致血液物质交换功能障碍，加重肝损伤，使肝纤维化难以逆转。

笔者认为，在诸多机制中，LSEC在肝纤维化中发挥导火线的作用。各种损伤因素首先作用于LSEC, 造成LSEC表型和功能变化，LSEC失窗孔加之EMC的积累继而形成肝窦毛细血管化，毛细血管化的LSEC是肝纤维化发生发展的必要条件。肝窦毛细血管化进一步导致HSC的活化，伴随着细胞因子的释放维持HSC的活化状态，同时也相应地导致更多的ECM沉积，进一步影响肝脏血液物质交换和微循环障碍。

目前多项研究[24,28,33]均已证明，肝窦毛细血管化在肝纤维化发展过程中发挥关键作用。国外的学者们对LSEC与HSC相互作用的机制研究更为深入。而我国在LSEC与肝纤维化的研究中，主要集中于各种肝纤维化动物模型，LSEC的形态变化，LSEC窗口变化对纤维化发展的影响以及肝窦状毛细血管化的LSEC表面分子及分泌的细胞因子的变化，总体来讲主要是现象研究，缺乏更为深入的机制研究，这也是需要改进的地方。另外我国作为传统中药的发源地，也报道了多种中药如扶正化瘀方、白芍总甙、芪术颗粒、虫草菌丝提取物等在肝纤维化动物模型中逆转肝窦毛细血管化、抑制肝纤维化的效果[39-41]。

2 针对LSEC逆转肝纤维化治疗的新靶点

对肝纤维化机制的深入了解，有助于寻找有效的抗纤维化的治疗方法。目前关于抗纤维化的成果颇多，但大部分停留在基础和动物实验研究上，尚无确切有效的抗纤维化药物。因此，在病因治疗的基础上，探讨LSEC在肝纤维化中的作用，可以为抗纤维化治疗提供新的线索。

2.1 抑制LSEC分泌的细胞因子和信号通路 抑制PDGF和TGFβ等可以调控HSC的活化，抑制ECM生成的细胞因子从而能够抑制肝纤维化发生。目前已经在评估几种人源化拮抗TGFβ的抗体，其中fresolimumab用于治疗转移性乳腺癌、非小细胞癌、弥漫性系统性硬化和节段性肾小球硬化的研究，正在处于Ⅰ期或Ⅱ期临床试验[42-43]。di Sario等[44]在SD大鼠实验中表明，吡非尼酮通过抑制蛋白激酶C介导的Na+/H+交换可显著抑制TGFβ诱导的Ⅰ型胶原产生，并抑制大鼠PDGF诱导的HSC增殖。目前，吡非尼酮用于治疗特发性肺纤维化已经在欧洲和日本等地上市，处于Ⅳ期临床试验阶段。

2.2 恢复LSEC的窗孔 HSC激活后转变为肌成纤维细胞是肝纤维化发生发展的中心环节。有窗孔的LSEC保持HSC的静默状态，通过药物促进LSEC的窗孔恢复，有助于改善HSC。You等[45]在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中发现，人重组的血管内皮细胞抑制素能够缓解肝窦状毛细血管化，但在其他原因造成的肝纤维化模型中的作用需要进一步研究。VEGF以2种途径即NO-依赖途径和非NO-依赖途径维持LSEC的窗孔表型, 而可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)是NO-依赖途径中的重要酶分子。Xie等[46]研究表明，sGC的激动剂BAY60-2667可以使毛细血管化的LSEC恢复至具有窗孔的已分化水平, 从而使HSC恢复到静默状态，抑制甚至逆转肝纤维化。目前，一种用于治疗充血性心衰的新型sGC激动剂BAY58-2667已经进入Ⅱ期临床试验，但是关于sGC的激动剂用于肝纤维化治疗的临床研究未见报道。

2.3 抗血管生成治疗 VEGF促血管生成作用最强，大部分抗血管生成疗法主要集中于阻断VEGF信号通路。在大鼠肝纤维化模型中，用贝伐单抗治疗通过中和肝细胞产生的VEGF并阻断其对HSC活化的影响可减轻肝纤维化[47]。近年来抗血管生成的方法包括使用多受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼,其靶向Raf/细胞外信号调节激酶和PDGFRβ信号级联以及VEGFR信号转导途径，与肝内纤维化发生和胶原沉积的显著减少有关[47]。但是多受体酪氨酸激酶抑制剂除了作用于LSEC上促血管生成的VEGF和纤维母细胞生长因子受体，还作用于其他多种细胞，并影响细胞增殖、ECM转运和免疫调节的其他激酶，因而特异性较差[48]。肝细胞和LSEC高表达的CD147，其可以通过VEGF-A/VEGFR2信号调节通路促进肝纤维化进展。通过阻断CD147，可抑制该信号通路介导的血管生成，有利于抑制肝纤维化[49]。

2.4 增加ECM降解和减少ECM产生 MMP是肝内ECM的主要降解酶，通过上调MMP或下调TIMP活性，有助于促进肝纤维化逆转。另外，ECM的胶原纤维交联，主要由赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)L2介导。LOXL2可能在纤维化逆转期间阻碍ECM降解，阻断LOXL2并且在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中已经观察到抗纤维化活性[50]。Simtuzumab(GS-6624)是LOXL2的非竞争性变构抗体抑制剂，临床已用于治疗纤维化疾病和癌症，并且正在进行特发性肺纤维化、晚期纤维化和肝硬化患者以及原发性硬化性胆管炎患者的Ⅱ期研究 。Simtuzumab(GS-4779)也应用于非酒精性脂肪肝和2期或3期肝硬化患者的Ⅱ期研究，其疗效有待于进一步验证和评估。也有报道[28]通过靶向 TIMP-2的siRNA治疗CCl4诱导的大鼠肝纤维化，抑制 HSC激活，促进 ECM 降解。

2.5 针对肝脏微环境，改善血管舒张功能 抗氧化剂如维生素A、E和黄酮类，可改善eNOS活性，增加NO的生物利用度并改善抗氧化酶活性，从而使NO增多。他汀类药物如辛伐他汀通过减少总胆固醇，改善Akt依赖的eNOS甲基化以及减少氧化型低密度脂蛋白等改善内皮细胞功能。非选择性β受体拮抗剂如卡维地洛和血管紧张素受体拮抗剂等也可作用于相应的受体，缓解氧化应激，舒张血管[51]。

3 小结

笔者认为，肝纤维化病理过程复杂，从LSEC毛细血管化到静息HSC的活化、ECM 的沉积以及肝纤维化的演进都涉及很多机制。对其中的任何一个过程进行干预都将对肝纤维化的逆转起着积极的作用。因此，在病因治疗的基础上，依据患者肝纤维化程度结合新型靶点抗纤维化药物治疗具有广泛的应用前景。sGC的激动剂等在肝纤维化的治疗中极具开发价值。联合其他靶点如抑制TGFβ和PDGF，增加ECM降解的药物也有不可忽视的作用。而抗血管生成疗法和改善微循环的药物，虽然对肝脏血管选择性较差，但是对于肝硬化后期门静脉高压患者，可根据具体病情选择性使用。

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引证本文：DU YQ, WU J, YANG DL. Role of liver sinusoidal endothelial cells in the development and progression of liver fibrosis and related therapeutic strategy[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(3): 438-444. (in Chinese)

杜艳芹， 吴珺， 杨东亮. 肝窦内皮细胞在肝纤维化发生发展中的机制及相关治疗策略[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(3): 438-444.

(本文编辑：王 莹)

Role of liver sinusoidal endothelial cells in the development and progression of liver fibrosis and related therapeutic strategy

DUYanqin,WUJun,YANGDongliang.

(DepartmentofInfectiousDiseases,UnionHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

Liver sinusoid endothelial cells are the first defense mechanism that protects the liver against various injuries, and they also play a significant role in the development of liver fibrosis and liver cirrhosis caused by chronic liver injury. They are involved in liver fibrosis by mediating liver inflammation, participating in sinusoid capillarization and revascularization, activating hepatic stellate cells, secreting many proinflammatory cytokines, participating in extracellular matrix formation, and mediating liver microcirculation disturbance. Clarification of these mechanisms helps to identify new targets and develop new regimens for the treatment of liver fibrosis.

liver cirrhosis; liver sinusoidal endothelial cells; therapy

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.008

2017-02-08；

2017-02-13。

杜艳芹(1991-)，女，主要从事肝病相关研究。

杨东亮，电子信箱：dlyang@hust.edu.cn。

R575.2

A

1001-5256(2017)03-0438-07