模式生物果蝇在中药活性评价及其治疗功效表征中的应用与展望

华永庆+朱悦+江帆+俞辰亚代+丁岩+段金廒

[摘要]果蝇作为生命科学领域中重要的模式生物，被广泛用于人类疾病的研究，这些研究促进了对病理生理活动中相关蛋白分子表达和信号通路的理解，同时，也建立了诸多具有丰富遗传特征的果蝇品系。人们发现，这些果蝇品系作为一类新兴人类疾病模型，可以被应用于活性评价及药物筛选。中药活性评价技术与方法的匮乏是制约中医药发展的瓶颈问题之一。果蝇因其繁殖迅速、生命周期短、整体作用、品系丰富、与人类高度相关等特点，尤其适用于成分复杂的中药的活性评价与筛选。该文就近年来利用果蝇进行的衰老、神经退行性疾病、代谢紊乱及糖尿病、睡眠障碍、肠道免疫、生殖、肿瘤、心脏功能等疾病模型的研究及药物活性评价的研究进展进行了综述。

[关键词]

果蝇；模式生物；抗衰老；神经退行性疾病；代谢紊乱；睡眠障碍；肠道免疫

果蝇是生物学与基础医学研究领域中极为重要的模式生物。果蝇的全基因组测序已于21世纪初基本完成，近75%的人类疾病基因在果蝇中有相对应的直系同源物。同时，果蝇携带许多便于遗传操作的表型标记、分子标记或其他特性的特征染色体。基于清晰的遗传背景和便捷的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分子生物学、神经科学等领域逐渐得到了广泛的应用。

果蝇具有繁殖速度快，生命周期短，生理结构简单，繁殖量大，培养费用较低等特点，且与哺乳动物在生理学、生物学和神经系统机能等方面比较相似。果蝇每12～16周完成1个世代，1对果蝇可产400～500只卵，染色体仅有4对（容易改造）。在一个较短的生命周期内（25℃左右，8～12d），果蝇的发育经历胚胎、幼虫、蛹和成蝇期4个阶段，每个阶段都可被应用于不同目的的实验研究。胚胎通常用于基础发育研究，以检测从神经元发育到整个发育模型的正确形成。幼虫通常被用于研究一些生理过程以及觅食行为。蛹可用于研究某些特定的发育过程。果蝇成虫大脑内约有10万多个神经细胞，可形成复杂的神经回路和神经纤维网，借此调节各种行为，如飞行、打斗、梳理、觅食、学习和记忆、睡觉和昼夜节律等。因此，许多作用于哺乳动物中枢神经系统的药物被证实能在果蝇的大脑内发挥同样的作用。近年来，果蝇作为新兴整体动物模型，通过转基因技术、基因定点敲除等有效的基因组操作，逐渐被应用于药物活性的评价以及先导化合物的高通量筛选，不仅缩短了研究周期，也降低了科研成本。中药，因其对人类健康的巨大贡献，日益受到国内外研究者的重视。但中药及方剂成分复杂，适宜的活性评价手段的缺乏仍是制约中医药研究的瓶颈问题。模式生物果蝇因具有上述特点，并可观察药物的整体作用，尤其适用于中药复方、单味中药及其成分的活性评价与筛选。

1果蝇在药物活性评价中的应用

1.1果蝇在抗衰老药物研究中的应用

果蝇作为一种真核多细胞生物，因其寿命短、繁殖力强，且其代谢、生理状况和生长发育等也同哺乳动物基本相似，是研究寿命及抗衰老药物的理想模型。影响衰老的因素很多，如遗传、环境、代谢等，影响衰老的信号通路如胰岛素信号通路（IIS）、雷帕霉素标靶（TOR）信号通路等也被证实在果蝇衰老中发挥重要作用。饮食限制、热量限制以及自由基清除剂均被证实具有抗衰老作用。与人工合成的抗氧化剂相比，一些中药经研究发现不仅具有较高的抗氧化活性，同时具有毒副作用较小的特点。果蝇寿命实验表明，中药复方如地黄饮子、参七片、乌杞胶囊及何首乌、当归、黄芪、丹参等7味药组成的补血复方确有延年益寿的功效。香椿子、六味地黄生物制剂正丁醇提取物、山楂醇提物通过抗氧化机制发挥延缓衰老作用。中药中的多糖类成分能不同程度延长果蝇寿命，如补益类中药党参、短柄五加、长山药、北五味子等，这一共性特征将有利于进一步探究补益类中药延缓衰老作用的物质基础。小分子多酚类物质白藜芦醇，可激活长寿基因SIRT1，进而影响下游因子及其信号通路的表达，发挥抗氧化、抗自由基、免疫调节、抗炎、神经保护等作用，多方面协同产生延缓衰老的作用。王沂等从厚朴中分离提纯厚朴酚，发现厚朴酚具有较强的过氧化物和羟基自由基清除能力，对果蝇细胞的生理及生化代谢过程起到保护作用，延缓细胞衰老，从而使果蝇寿命延长。

尽管许多中药通过果蝇寿命实验证实其抗衰老作用，但研究结果多数局限于对果蝇体内少数与自由基氧化相关的指标及给药组存活数的测定，而未能深入探讨果蝇寿命延长的分子机制。戴秋萍等利用基因芯片表达技术研究番茄红素对果蠅寿命的影响，初步发现涉及信号传递、物质代谢、转录、肿瘤抑制等过程的98个基因在加入番茄红素10d后上调。上述研究开启了一种新的研究模式，应用组学技术可高效地确定药效物质及其作用机制，便于深入细致地探讨中药的抗衰老作用。

1.2果蝇作为神经退行性疾病模型的研究及应用

人类神经退行性疾病主要是一类由神经元的退行性病变和凋亡导致个体死亡的疾病，包括阿尔茨海默病（Mzheimers disease，AD）、帕金森氏病（Parkinsons disease，PD）、多聚谷酰胺疾病（polyglutamine disease）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotro—phie lateral sclerosis）等。果蝇不仅具有与人类神经退行性疾病同源的致病基因，等基因，在发生过程等方面亦有与人类相似的表型，这使得果蝇成为研究人类神经退行性疾病极为简单、高效的工具。可用果蝇研究的神经退行性疾病模型和相应的果蝇表型见表1。各类果蝇模型的表型存在一些共性特征，如视网膜变性、运动缺陷、爬坡缺陷和寿命缩短等方面。因此，治疗神经退行性疾病的药物筛选可选取特定表型作为评价指标，如观察药物对眼部粗糙病变、运动及爬坡缺陷的改善和正常活动的恢复。

利用分子遗传学方法构建的Gal4/UAS系统可以使特定基因在果蝇的特定部位和不同的发育阶段特异性表达，目前已通过正向遗传学方法、逆向遗传学方法及转基因方法构建了包括AD，PD在内的多种神经退行性疾病的模型，这些模型的建立将有利于药物作用靶点的发现和药物进一步筛选。

目前药物筛选中观测较多的指标有视网膜的退化程度、眼部病变、寿命情况和行为学能力等。以转基因果蝇为模型，杨巧巧等发现桑杞脑康颗粒对AD有认知改善作用。地黄饮子可通过上调转Tau基因果蝇P13K，AKT，dTOR mRNA的表达，改善其学习记忆能力。进一步实验表明，地黄饮子调控的dTOR信号通路中，4E-BP和p70S6k的mRNA和蛋白表达下调。Liu等通过AD果蝇模型筛选体系，评价临床使用的23种植物药的神经保护活性，筛选出5种具有显著抗蛋白神经毒效应的提取物，包括芫荽、甘松、何首乌、地黄、花楸等。进一步实验表明，何首乌提取物分离得到的单体成分二苯乙烯苷（2，3，5，4一四羟基二苯乙烯2-0-β-D葡萄糖苷）在果蝇和人类细胞上显示出类似的抗蛋白神经毒的神经保护活性。姜黄素、藿香中提取的金合欢素、蓝光激发的TPPS（四苯基卟吩）、强力霉素、y-分泌酶抑制剂L-685458、阿片受体拮抗剂nahrindole等单一中药成分或化学物质均可调节β-淀粉样蛋白（Aβ）的过度表达，缓解Aβ过表达引起的神经损伤，改善运动障碍或其他方面的缺陷。番茄红素使Aβ果蝇脑组织病变空泡形成减少，同时使果蝇体内SOD活性增强，初步表明番茄红素的神经保护作用机制可能与其抗氧化活性有关。上述研究证明了以转基因神经退行性疾病果蝇模型筛选药物的可行性，将其应用于具有神经系统药理活性中药如芳香化湿药、安神药、平肝熄风药、补阴药等药物的筛选与研究，将有利于深入挖掘中药对神经退行性疾病的治疗作用。

利用果蝇研究神经退行性疾病取得了极大进展，在此过程中建立了大量的相关疾病模型品系，使得该类模型成为目前可以获得的最为丰富且成熟的果蝇疾病模型。然而，这些模型也存在诸多缺点：果蝇疾病模型常在早期发育阶段（如幼虫、蛹、幼年成虫等）就可产生显著表型，而在人类相应疾病中则往往在老年阶段才表现出明显症状；果蝇眼睛和光感受器神经元对致病基因的毒性效应较为敏感，多数果蝇疾病模型选择眼部粗糙病变等表型作为研究指标，然而，其眼部结构无法模拟人类大脑的复杂回路和病理生理学特征，故果蝇模型不能完全模拟人类疾病特点；果蝇的免疫系统相比哺乳动物更简单，无法通过果蝇模型深入研究神经炎症在退行性疾病中发挥的作用；果蝇和人类大脑在解剖学上也存在显著不同，例如，果蝇大腦没有黑质，利用果蝇研究黑质在多巴胺能神经元丧失的帕金森病中发挥的调节机制将受到限制；⑤果蝇和人类的细胞和分子渊控过程也有差异，一些参与调节特定疾病信号通路的关键分子，在果蝇中可能缺失，如a-synuclein，行且，从果蝇实验中取得的研究成果可能与人类疾病通路不具有生物学相关性。

1.3果蝇作为代谢紊乱及糖尿病模型的研究与应用

果蝇的代谢过程、葡萄糖稳态和内分泌调节与人类具有高度的相关性，果蝇也被证实是研究代谢紊乱和糖尿病等疾病治疗方法的有效模型。尽管果蝇没有分泌胰岛素的胰腺，也没有肝脏，但果蝇大脑脑间部存在能够分泌与代谢相关的胰岛素的神经分泌细胞，其他的分泌细胞能分泌胰高血糖素样的物质，它们在生理和基因上都表现出与脊椎动物内分泌相似的表征。去除果蝇胰岛素分泌细胞，可导致其血淋巴内葡萄糖水平升高、脂肪循环加强和饥饿抵抗。果蝇体内的脂肪细胞和脂肪体与哺乳动物肝脏中的脂肪细胞具有相似的功能，参与脂代谢及糖原储存，开通过与哺乳动物类似的胰岛素机制进行调节。

果蝇模型近年来逐渐被用于糖尿病等代谢疾病治疗药物的筛选。果蝇可表达与人类磺酰脲类药物受体及内向整流钾通道同类蛋白，并形成ATP敏感钾通道来调节某些果蝇激素（如脂动激素）的释放。已在临床使用的糖尿病治疗药物优降糖和甲糖宁，即可通过与果蝇神经分泌细胞上ATP敏感钾通道的相互作用，调节其体内的葡萄糖水平。近年研究证实，通过给予高糖、高脂膳食可导致果蝇产生与人类疾病相似的糖代谢异常。研究表明，丹参一三七复方、鬼箭羽配伍荔枝核醇提物、CoA前体一维生素B5可有效改善高糖模型果蝇的脂质代谢、糖代谢。植物雌激素樱黄素、茶多盼类物质表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）分别通过上调长寿基因sirtuin 1（Sir2）、下调胰岛素样肽5和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶以及Upd2蛋白的表达，降低果蝇体内葡萄糖水平，改善果蝇健康并延长其寿命。本课题组采用高糖成功诱导了果蝇代谢紊乱模型，并发现丹参茎叶提取物具有一定降糖作用，证实该模型具有经济、简便、周期短、与人类高度相关等优点，值得进一步探索及应用。

另外，果蝇胰岛素的缺乏使其生长迟缓，体长变小，这在幼虫和成虫上都能体现。体长作为一个极易观察的表型，有利于通过高通量筛选、发现促进胰岛素分泌缺乏突变果蝇的生长的小分子化合物，其在药物发现、筛选和验证等阶段均有较好的应用前景。Brookhean等还利用果蝇模型研究产妇肥胖对子代产生影响的作用机制，这也为研究肥胖的遗传效应提供了新方法。

尽管果蝇代谢过程的分子机制在一定程度上与人类相似，但其调节代谢过程的结构基础与人类也存在差别，因此在临床有效的药物在果蝇上未必能够表现出作用。例如磺酰脲类药物能有效作用于胰岛素缺乏的果蝇，而二甲双胍的有效性则无法通过果蝇的上述表型证实。

1.4果蝇作为睡眠模型的研究及应刚近几年来，果蝇逐渐成为睡眠行为研究的新型模式生物。它与哺乳动物在睡眠医学方面，有以下相似之处：①果蝇的睡眠具有持续性静止和增高的激醒反应阈，且当果蝇被剥夺一个晚上的睡眠时，在第2天会表现出明显的代偿式休息延长，年幼果蝇比成熟果蝇睡得更多，年龄越大的果蝇有更多的片段式睡眠，这些行为与人类睡眠类似；②果蝇有睡眠压力现象，即保持清醒状态时间越长，睡眠时间越长，深睡期越长；③果蝇的睡眠受到昼夜节律和内环境的调节；④失眠的果蝇免疫系统会受到影响从而更易被感染，这与人类睡眠和免疫系统问的关联性一致。通过监测果蝇的活动节律，研究人员已通过果蝇鉴定出多个包括period（per），timeless（tim），clock（elk），cycle（eye）在内的时钟基因。影响哺乳动物睡眠和觉醒的某些分子标记物在果蝇中也发挥类似的作用。如Fmrl基因影响与睡眠相关的突触的重整化过程，使突触强度增加、果蝇睡眠延长。

近年来，应用果蝇模型筛选治疗睡眠疾病药物、探索药物作用机制的实验相继展开。采用光照等方法可建立果蝇睡眠剥夺模型。由此发现，四逆散冻干粉具有促进睡眠的作用，其作用机制是提高果蝇头部5-HT的含量、上调果蝇脑内5-H。受体表达。刺五加不仅能够促进睡眠，其作用机制涉及的基因已通过基因技术初步发现，它还对睡眠节律有调节作用，可减少24h持续黑暗环境下果蝇的片段化睡眠。酸枣仁皂苷A，B分别通过影响果蝇夜晚活动及白天睡眠共同改善果蝇睡眠。咖啡因通过作用于多巴胺信号通路引发觉醒。

随着研究深入，研究者发现睡眠不仅受年龄、昼夜节律、免疫反应、神经递质、基因调控等因素影响，亦与代谢、学习记忆、应激反应、细胞膜兴奋性等因素关系密切。采用果蝇作为模式生物研究睡眠仍存在一些瓶颈问题。以往多数研究中，研究者给予休息状态的果蝇机械刺激，虽然可在行为水平证实果蝇休息状态类似于哺乳动物睡眠状态，但对于果蝇休息与睡眠状态的界定仍不明确。虽然在果蝇群体监控器中监测果蝇运动或休息时间段的方法简易可行，但是睡眠行为的特征及相关监测指标还有待进一步发掘和完善。

1.5果蝇在肠道免疫实验中的应用果蝇没有B和T淋巴细胞，它主要依赖于抗菌肽介导的体液免疫和血细胞介导的细胞免疫。表皮及肠道等组织由于更容易接触大量微生物，构成了抵抗微生物入侵的第一道防线。在果蝇体内，双重氧化酶（DUOX）产生的活性氧（ROS）与核转录因子NF-KB信号通路产生的抗菌肽为肠道提供了广谱抗菌作用。同时，肠道上皮细胞通过多种负调控机制来调节DUOX-ROS与NF-KB-AMP免疫系统，由此对共生菌群产生免疫耐受。

有研究者建立果蝇肠道氧化应激损伤模型，以果蝇生存率反映药物对氧化应激损伤的作用，再从中分析果蝇寿命、肠道干细胞和成肠细胞数量的变化等来探讨中药的免疫调节机制。其中，红景天可有效减少果蝇肠道上皮细胞的死亡并降低肠道上皮细胞内的ROS水平，保护行维持肠道形态。瓜蒌、红花、川芎和菊花提取物可提高果蝇的肠道免疫功能。刺五加提取物对肠道免疫功能的改善作用与缓解肠壁细胞凋亡有关，行使体内部分抗菌肽表达增多。植物雌激素樱黄素虽然能够改善肠上皮细胞屏障功能，提高正常果蝇存活率和健康状况，但其对于过氧化损伤的肠道并没有保护作用，因此樱黄素作为预防药物使用可能优于治疗药物。因此，除了应用果蝇模型进行改善肠道免疫功能药物的筛选，肠完整性对药物改善作用的影响也值得深入探索。

1.6果蝇在生殖系统功能评价中的应用

鉴于果蝇繁殖力强、繁殖周期短的显著特点，果蠅常被应用于影响繁殖力药物的筛选。通过果蝇繁殖力实验，发现北五味子、短柄五加果可增强果蝇繁殖力。厚朴中的厚朴酚对果蝇的繁殖力及其产卵、蛹和幼虫发育过程均有促进作用。甜叶菊糖苷对雄性果蝇生殖能力的损伤程度高于其对雌性果蝇的损伤，但215%的甜叶菊糖苷对果蝇行无明显遗传毒性。上述研究为筛选影响生殖力的药物提供了更多途径。果蝇模型也可用于研究药物的遗传毒性，可以显著缩短药物毒理实验的研究周期。

1.7果蝇作为其他疾病模型的研究进展

果蝇作为模式生物在肿瘤学研究中获得了较好的应用。果蝇在肿瘤学研究中具有如下优势：①在信号传导通路方面，果蝇和人类有高度的保守性，因此以果蝇为模型的原癌基因研究也为人类癌症研究做出了重大贡献，如Patched作为肿瘤抑制基因的确定，源于对果蝇patched/hedgehog信号通路上Patched突变的深入研究，该信号通路上的其他基因也逐渐被发现与肿瘤形成有关；②果蝇基因的可操作性使果蝇易于研究基因的异常表达，这一特点极其适合正常致癌基因的异常活化或过度表达的研究；⑧与哺乳动物相比，果蝇相对缺乏基因冗余，这使得果蝇作为模型研究时更易检测出相关的表型。果蝇也因具有开放的循环系统、不具有获得性免疫功能等特点，而行非适合肿瘤发生的所有方面的研究，但这些利用果蝇进行的肿瘤方面的研究已取得丰硕成果，这必将推动其进一步在抗肿瘤药物筛选中的应用。

果蝇在心脏功能研究中也得以应用。果蝇是具有心脏的无脊椎动物，且心脏组织分化精细，可用于研究心脏遗传与发育基因调控。张艳阳等通过果蝇心力衰竭模型从164个果蝇第2号染色体缺失系中获得33个表现心力衰竭频率高的候选品系，为进一步完善果蝇心脏衰老模型奠定基础。近年来，果蝇逐渐被用于研究胰岛素信号通路、饮食限制、钾离子通道等因素对心脏衰老的影响及作用机制。果蝇还可用于研究更高种属心脏调节、心脏节律、心肌收缩的非自律结构。筛选发现抗氧化酶sod2果蝇突变体心脏功能衰退与正常果蝇生命后期心脏功能衰退具有相似特征，这些成果促进了人们对果蝇心脏功能模型的进一步研究。根据果蝇逆重力爬行的生理特性，郑澜等采用果蝇平台运动，研究5种不同持续时间的运动方案对果蝇运动能力、生命周期及心脏功能的影响，研究初步表明坚持连续3周以上、每天适量运动2.5h，不仅可改善增龄衰退的运动能力，延长平均寿命，还能减少心脏衰竭的发生，起到保护心脏的功能。这一优化的运动方案可辅助临床药物的治疗作用。

2果蝇在中药功效表征中的应用与展望

目前，果蝇在中药功效表征中已经获得较好的应用。果蝇模型尤其在补益类药物功效的活性评价中应用较多。大量的实验已经证实，此类药物能够延长寿命，行具有抗氧化，增强生殖能力，提高肠道免疫功能等作用。活血化瘀药物及含有植物雌激素类药物，可表现出抗氧化，改善代谢紊乱等活性，使用果蝇衰老模型及高糖高脂负荷诱导的果蝇代谢紊乱模型或糖尿病模型可很好的验证此类药物的作用。滋阴类药物常具对神经系统的保护作用，可用神经退行性疾病果蝇模型进行评价，如阿尔兹海默疾病模型、帕金森模型、亨廷顿疾病模型等，有较多的模型可供选择，尤其是AD模型应用较多，许多中药或植物提取物在此类模型上已被证实具有显著的神经保护作用。厚朴、藿香等芳香化湿药物具有抗痴呆作用，在果蝇的神经退行性疾病模型中也得以证实。安神类药物的功效，可采用睡眠模型进行研究，如酸枣仁已被证实具有显著的改善睡眠作用。上述模型能够较好的体现中药的活性及作用特点，在中药的活性评价及筛选中具有广阔的应用前景。

近一个世纪以来，果蝇在生物学研究的舞台上占有举足轻重的地位。由于其自身的诸多特点，随着果蝇病理模型和转基因果蝇品系的不断丰富，果蝇模型在对生殖、免疫、神经、心血管等系统以及神经退行性疾病、代谢综合征、睡眠等疾病机制的研究中发挥日趋重要的作用。另一方面，果蝇作为肿瘤、心脏衰老等模型的研究还有待深入。在中医药发展的新机遇下，中药药理研究面临众多新的考验，而疾病动物模型的缺乏是制约其发展的关键科学问题。以中医药理论为指导，利用众多符合中药作用特点的果蝇病理模型，对中药进行多指标活性评价及筛选，这不仅符合中药药理作用的多靶性、多重调节等特点，也体现了中医的整体观，可大大提高中药活性筛选的效率，有利于进一步阐释中药及其复方的作用机制，推动中药的产业化和国际化。