基于UPLC—Q—TOF—MS技术的北青龙衣有效成分动态变化分析

霍金海+孙国东+董文婷+王伟明

[摘要]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析不同采集时期北青龙衣有效成分动态变化规律。用MarkerView软件对6个采集时期18批样品测定数据进行主成分分析，差异性化合物通过Peakview 2.0/Masterview1.0软件，依据精确质量数和同位素峰度比确定分子式，再通过对照品及数据库的二级谱图比对、裂解规律分析，结合已有文献报道，确定结构式。结果表明不同采集期萘醌类有效成分含量发生了明显的变化，鉴定或推断了北青龙衣中38个萘醌类化合物结构，随着采收时间的变化大部分萘醌类成分含量逐渐下降。该方法快速、准确，为北青龙衣的化学成分鉴定与分析提供一种新的策略，为揭示不同生长期北青龙衣有效成分动态变化规律及确定其药材合理采收期提供基础资料。

[关键词]液相色谱-四极杆飞行时间质谱；北青龙衣；萘醌；动态变化

北青龙衣为胡桃科胡桃属植物核桃楸Juglansmandshurica Maxim.未成熟果实的外果皮。民间多年来一直用于治疗恶性肿瘤，国内外学者对其抗肿瘤活性进行了大量的报道。目前，从青龙衣中分离得到的化合物有萘醌类、黄酮类、二芳基庚烷类、萜类、鞣质类、多糖类、有机酸类及挥发油等，其中萘醌类是公认的抗肿瘤主要成分。

胡桃科Juglandaeeae共9属71种植物，其中以胡桃楸J.mandshurica及胡桃J.regia L.作为药用植物报道较多。但不同标准规定的药用部位及采收时期差异较大。其中《黑龙江省中药材标准》收载的北青龙衣为核桃楸未成熟果实的外果皮。《中药大辞典收载》收载的核桃楸果为核桃楸的未成。“三月茵陈四月蒿，五月六月当柴烧”是古人对中药采收期精辟的经验总结，过季则有药无性。尤其是果实成熟期青龙衣萘醌类成分含量极低，作为食用核桃采收时的废弃副产品，以低廉的价格大量充斥市场，势必影响临床疗效。

本课题组前期研究表明不同采收时期青龙衣有效成分含量差异较大，但关于不同采收时期青龙衣中胡桃醌含量变化的报道结论不一致，这可能与萘醌类成分之间相互转化有关。单一测定一个或几个成分的含量难以全面体现药材的内在质量。因此，亟需一种分析手段全面反映北青龙衣不同采集时期有效成分的动态积累规律，为药材采收期的确定提供科学依据。

超高效液相色谱（UPLC）通过在色谱柱上使用小颗粒填料以及其他部件的改进，具有更高的分离度、更快的分析速度和更大的峰容量等优点。四级杆.飞行时间串联质谱（Q-TOF）为高分辨质谱仪，不仅具有高分辨、高选择性的特点，通过精确的相对分子质量快速确定化合物分子式。还可以通过高低能碰撞扫描，提供丰富的二级质谱信息，再通过对照品比对及裂解规律分析，从而鉴定或推断化合物结构。近年来，将液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度相结合，尤其是与高分辨质谱和多级质谱联合使用的技术手段，已广泛应用于中草药成分的全面分析。也为研究天然产物动态积累规律开辟了全新的途径，但该领域的研究报道较少。

本研究采用超高效液相色谱一四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术对不同采集期北青龙衣进行在线分离分析研究，通过化学计量学模式确定其主要化学成分变化。利用UPLC一维的保留时间锁定化合物，通过二维的精确质量数和同位素峰度比确定分子式，再通过对照品比对或质谱裂解规律分析确定或推断其结构式，通过有效成分动态变化分析，以期为北青龙衣的采收期的确定提供科学依据，亦为胡桃属药用植物萘醌类成分的质谱裂解途径研究提供借鉴和参考。

1材料

1.1仪器

ACQUITY UPLC（美国Waters公司，包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱）；ABSCEIX Triple-TOFT 5600 质谱仪（AB SCIEX，USA，配有ESI源和APCI源），数据采集软件：Analyst TF1.6software（AB SCEIX，USA）；数据处理软件系统：Peakview 2.0/Masterview1.0 software（AB SCEIX，USA），Markerviewl.2.1（AB SCEIX，USA）；WatersAcquity UPLC BEH C¹⁸色谱柱（2.1mmx100mm，1.7μm），AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column预柱（2.1mmx5 mm，1.7μm）。

KQ-300DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；BSA224S-CW型电子天平（赛多利斯科学仪器公司）；LGl6-W型高速离心机（北京京立离心机有限公司）。

1.2试剂

甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，Merck，Germany），甲酸（色谱纯，Fisher，USA），蒸餾水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.3药材与对照品

北青龙衣分别于2015年6月29日，7月15日，8月1日，8月16日，9月1日，9月15日采自哈尔滨市东北农业大学（东经126°7334.9”，北纬45°7488.6”），每采集期（1～6号采集期）以10棵核桃楸为1组样本，共计3组。上述样品均经初东君主任药师鉴定为胡桃科植物核桃楸J.mandshurica的果实。剥取外果皮，通风处阴干。

胡桃醌（供含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司提供，批号H-075.131230）；胡桃酮（自制，HPLC面积归一化法测定纯度>98%）。

2方法

2.1对照品溶液的制备

精密称取胡桃醌、胡桃酮对照品适量，加甲醇制成50mg·L^-1的溶液作为对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

取不同采集时期北青龙衣药材1.0g，加甲醇25mL，精密称定，超声处理30min（功率300w，频率40kHz），放冷，补足甲醇，摇匀，滤过，取续滤液于一80℃冻存，分析前恢复室温，13000r·min^-1离心10min，取上清液，即得，样品标号为BQLY。