荷叶对高脂高糖致NAFLD大鼠炎症因子水平及AdipoR2表达的作用研究

杨丹虹+楼招欢+程斌+张光霁+汪洋鹏+徐浩

[摘要]荷叶是“药食两用”中药材，具有降脂功效。为观察LL对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝（NAFLD）的作用及可能的作用机制，该实验采用高脂饲料加饮用果糖溶液建立NAFLD大鼠模型，造模同時灌胃给予荷叶混悬液，血生化仪及EⅡsA法检测血清ALT，AsT，cr，BuN，TNF-a，IL-6，INS，GLU，ADPN，LEP及肝组织NF-KB，TGF水平；HE染色进行肝组织病理学检查；RT-PCR，Western blot法检测肝组织AdipoR2 mRNA和蛋白表达情况。结果显示，荷叶能显著降低模型大鼠血清ALT，AST，IL-6水平及肝组织NF-KB，TGF水平，升高脂联素水平，增加肝组织AdipoR2蛋白的表达，改善肝细胞脂变。提示，荷叶对高脂高糖致NAFLD具有保护作用，该作用与促进AdipoR2表达，改善胰岛素抵抗，降低炎症因子表达水平，抑制炎症反应有关。

[关键词]荷叶；非酒精性脂肪肝；炎症；胰岛素抵抗

随着社会的发展及生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病率逐年上升，且有低龄化趋势，已是当前全球范围重要的公共健康问题。现有西药疗效单一，且存在不同程度的毒性和不良反应；中医药防治NAFLD具有良好的疗效和独特的优势，发展前景广阔。荷叶是睡莲科植物莲的叶，含有槲皮素等黄酮类成分、荷叶碱等生物碱类成分。以往研究表明，荷叶总生物碱、荷叶黄酮具有降脂减肥、抑制肝脂质沉积等作用，含荷叶组方制剂具有确切的抗非酒精性脂肪肝作用，但是单味荷叶抗非酒精性脂肪肝病的作用研究鲜有报道。随着荷叶列入“药食两用的中药材”目录，荷叶粉在食品、保健食品中的应用也日益增多，相应的药理作用等基础研究也日益迫切。本文拟在前期研究基础上，观察新鲜荷叶经特殊工艺制成的天然超细粉末对高糖高脂诱导的NAFLD大鼠炎症因子及胰岛素抵抗相关因子表达水平的影响，探讨荷叶对NAFLD的防治作用及可能机制，为进一步荷叶粉相关产品的开发提供依据。

1材料

1.1动物SD大鼠，SPF级，雄性，体重180～200g，28只，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，合格证0012051，许可证号SCXK（浙）2014-0001。于室温（23±2）℃，相对湿度50%～70%饲养，自由饮食饮水。

1.2药物及试剂荷叶粉由杭州沃亚生物科技有限公司提供，临用前取荷叶粉适量，用纯水配置成60 g·L^-1的混悬液，即得。阳性对照药：易善复（多烯磷脂酰胆碱胶囊，赛诺菲医药公司），临用前用蒸馏水配制成质量浓度为13.68 g·L^-1。高脂饲料委托浙江省医学科学院实验动物中心制备。丙氨酸转氨酶（ALT），天门冬氨酸转氨酶（AST），尿素氮（BUN），肌酐（CR）试剂盒购自宁波美康生物科技股份有限公司；考马斯亮蓝试剂盒（批号20150109）购自南京建成生物工程研究所；大鼠肿瘤坏死因子-a（TNF-a），白介素6（IL-6），转化生长因子（TGF），核录因子KB（NF-KB），葡萄糖（GLU），胰岛素（INS），瘦素（LEP），脂联素（ADPN）ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3仪器ACCUTE TBA40FR全自动生化分析仪（东芝三厂医疗株式会社）；Power Wave 340酶标仪（美国Bio-TEK公司）；Mx3005P荧光定量PCR仪（美国Agilent Stratagene）。

2方法

2.1分组与给药大鼠适应性喂养3d后，称定体重，禁食12h后眼眶静脉丛采血，测定血清中TC，TG水平，根据TC，TG水平随机分为4组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组（易善复136.8 mg·kg^-1）、荷叶组（600 mg·kg^-1），每组7只。除正常对照组外，其余大鼠均定量给予高脂饲料和10%果糖水，连续18周。自造模第1天起，除正常对照组和模型对照组灌服蒸馏水外，其余各组分别灌胃给予相应剂量药物，每日1次，灌胃容积为0.01mL·g^-1，连续18周。

2.2一般行为学观察每日观察各大鼠进食、毛发、粪便、活动、死亡情况。

2.3血液样本制备于实验第18周，末次给药后禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，下腔静脉采血，3 500 r·min^-1离心10min，取血清，备用。

2.4肝组织样本制备采血后迅速分离肝脏，冰生理盐水洗净血渍，取肝右叶组织，中性福尔马林固定，供肝组织病理学检查用；取同部位肝组织约0.5g，加入预冷的0.9%生理盐水4.5 mL，在冰水浴中高速分散器充分研碎，3500r·min^-1离心10min，取上清液，即为10%肝组织匀浆，备用；另取同部位肝组织适量置冻存管内，加入RNA-later液置4℃冰箱24h后，置-80℃冰箱保存，供RT-PCR和West-ern blot检测。

2.5胰岛素抵抗相关因子水平检测

全自动生化分析仪测定GLU水平，ELISA法测定血清INS，LEP，ADPN水平，具体操作参照试剂盒说明书进行。胰岛素抵抗指数IRI、胰岛素敏感指数ISI的计算：采用稳态模型（HOMA）胰岛素抵抗计算法，计算公式如下：IRI=（FIN×FPG）/22.5；ISI=1/（FINxFPG）x100%。

2.6炎症因子水平检测

ELISA法检测血清TNF-a，IL-6及肝组织TGF，NF-KB表达水平，具体操作参照试剂盒说明书进行。

2.7肝组织AdipoR2 mRNA表达水平检测

采用荧光定量PCR检测。取-80℃冰箱保存的肝组织，总RNA提取试剂盒提取肝脏组织总RNA，DNase I 37℃消化5min，反转录试剂盒反转录总RNA，获得cDNA，荧光定量PCR检测表达水平。Primer5和DNAman软件设计AdipoR2基因的定量PCR引物，actin为内参（引物序列信息见表1）：定量PCR反应条件：94℃1 min；95℃10 s，58℃10s，72℃10 s（40个循环）。