梅花鹿鹿茸Ⅰ型胶原对大鼠成骨样细胞（ROS1728）的影响及其分子机制的研究

王艳双+罗速+张大方+曲晓波+李枫

[摘要]该文研究梅花鹿鹿茸Ⅰ型胶原（SPC-Ⅰ）对大鼠成骨样细胞R0s1728的影响，为SPC-Ⅰ抗骨质疏松的治疗提供理论依据。采用贴壁法培养大鼠成骨样细胞ROS1728，通过CCK-8法检测SPC-Ⅰ对ROS1728细胞增殖的影响，利用RT-PCR法检测成骨相关基因Runx2，osernniX，ALP，CoⅡ-I，OC的表达，利用Western-bolt法检测Runx2蛋白的表达。结果表明SPC-I质量浓度5g·L^-1组轻度抑制ROS1728细胞的增殖，但能够明显促进ROS1728细胞特异性转录因子Runx2，osterix mRNA的表达，Runx2蛋白的表达，以及标志基因ALP，coⅡ-I，OC mRNA的表达（P<0.01），并且呈现出时间依赖性。SPC-I质量浓度2.5，10g·L^-1组均明显抑制ROS1728细胞的增殖（P<0.01），并抑制相关基因的表达。该实验证明质量浓度5 g·L^-1组轻度抑制ROS1728细胞的增殖，但可以明显增强ROS1728细胞的功能，通过调控Runx2基因的表达，促进ROS1728细胞的分化、成熟。

[关键词]梅花鹿鹿茸I型胶原（SPC-I）；大鼠骨肉瘤成骨样细胞系ROS1728；分子机制

正常骨组织代谢是一个动态的骨重建平衡。成骨细胞在骨重建中起着关键作用，它不但能分泌大量的骨胶原和其他骨基质，而且能分泌一些重要的细胞因子和酶类，启动骨的形成过程，同时也能通过这些因子将破骨细胞偶联起来，控制破骨细胞的生成、成熟和分化，抑制骨吸收。骨重建是骨形成和骨吸收有序而精细的偶联平衡。当成骨细胞的数量减少、功能降低时，则骨形成减少，而破骨细胞造成的吸收陷窝不能及时被新骨所填补，成骨细胞与破骨细胞的偶联失去平衡，最终导致骨质疏松的發生。因而导致骨质疏松发生的关键取决于成骨细胞的数量和功能状态，因此成骨细胞的研究已经成为骨代谢研究领域的一个热点。

鹿茸属于珍稀名贵的动物性药材，具有强筋壮骨的确切疗效。研究表明鹿茸中含量最多的蛋白质是胶原蛋白，胶原蛋白是构成骨组织的结构蛋白，可用于骨代谢性疾病及骨质疏松症的治疗。梅花鹿鹿茸I型胶原可以通过RANKL/OPG信号转导通路抑制破骨细胞的功能，也能诱导BMSCs向成骨细胞方向分化。本研究可为SPC-I抗骨质疏松的治疗提供理论依据。

1材料

大鼠成骨样细胞（ROSl728）购自上海复旦大学细胞中心。SPC-I（相对分子质量3.1X10⁴，质量分数56.89%）购自长春中医药大学；DMEM-HG培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶，乙二胺四乙酸购自美国Sigma公司；青霉素，链霉素粉剂购自华北制药股份有限公司；RT-PCR试剂盒，引物合成由上海生物工程有限公司提供；Trizol试剂购自Invitrogen公司；氯仿，异丙醇购自北京鼎国生物；CCK-8试剂盒，IP细胞裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，上样缓冲液（5X），电泳缓冲液，预染蛋白Marker，Western-blot转膜缓冲液，封闭液，洗涤液，一抗和二抗稀释液，DAB-HRP显色试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；兔抗大鼠Runx2单克隆抗体，羊抗兔IgG/HRP多克隆抗体购自美国BD公司；兔抗大鼠actin多克隆抗体购自武汉博士德。

CO₂细胞培养箱购自日本SHELLAB；生物洁净安全柜购自苏净设备公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS CK40；全自动酶标仪，全自动凝胶成像仪，PCR仪，湿式转膜槽购自美国BIO-RAD公司；低速离心机购自日本HITDCHI；水平电泳槽，垂直板电泳槽，电泳仪购自北京六一仪器厂；恒温摇床购自美国Thermo Forma公司；低温冷冻离心机购自美国Thermo公司。

2方法

2.1ROSl728细胞复苏、培养、传代从 -80℃冰箱中取出冻存细胞，立即将冻存管置入37℃水浴中，使其迅速融化，消毒后移入超净台，将细胞悬液置入离心管中，加入DMEM-HG完全培养液5mL，1500r·min^-1离心5 min，弃上清。然后用含20%胎牛血清、100 u·mL^-1青霉素、100 u·mL^-1链霉素的DMEM-HG完全培养液5mL稀释后，接种于25c㎡培养瓶中，于37℃，5%CO₂，饱和湿度的培养箱中培养。待细胞贴壁生长至80%～90%时，倒掉培养液，PBS液洗涤后，加入0.25%胰酶+0.02%EDTA的消化液1.5 mL，使胰蛋白酶流遍细胞表面，倒置显微镜下观察，见细胞质回缩，伪足将要消失时，向培养瓶中加入3 mL完全培养液终止消化。用吸管按一定顺序吹打贴壁细胞成单细胞悬液，收集于离心管中，1 500 r·min^-1离心5min，弃上清，重新加入DMEM-HG完全培养液，重悬，按1：2接种在新培养瓶中继续培养。

2.2SPC-I对ROSl728细胞增殖的影响

取对数生长期的ROS1728细胞，消化，重悬，计数。以2.5x10⁴个/mL接种于96孔培养板，每孔200μL，每组3个复孔。实验分5组：对照组（空白对照组只加完全培养液，阳性对照组加地塞米松1x10^-8mol·L^-1）；药物组（I型胶原蛋白2.5，5，10g·L^-1）。24h后更换条件培养液。第1～7天各取出一块96孔板，每孔加入CCK-820μL，1h后在酶标仪450nm测定吸光度（A），绘制各组细胞的生长曲线，并计算细胞增殖抑制率。细胞抑制率=（1-AA）X100%。

2.3 SPC-I对ROS1728细胞相关基因的影响

取对数生长期的ROS1728细胞，消化、重悬、计数，以2.5x10⁴个/mL接种于6孔培养板，每孔2mL，每组3个复孔，实验分组同上，24h后更换条件培养液。分别在条件培养后48，72h后，RT-PCR检测Runx2，osterix，ALP，OC，Coll-I，G3PDH基因的表达，基因序列见表1。采用Trizol试剂提取细胞内总RNA，检测其完整性。以总RNA为模板，Oligo为引物，逆转录酶AMV 42℃进行逆转录反应，以所得的cDNA为模板进行PCR反应。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳结束后，以全自动数字凝胶成像仪保存图像并用Quantiyt One软件扫描分析，将所扩增特定产物的光密度与管家基因产物的光密度的比值作为评价基因表达水平的指标。登录GenBank

（http：//www.ncbi.nih.gov/Entrez/ne-cleotide），检索目的基因的cDNA全长核苷酸序列，用primeir5.0引物设计软件设计，由上海生工合成。

2.4SPC-I对ROSl728细胞Runx2蛋白表达的影响取对数生长期的ROSl728细胞，消化、重悬、计数，以2.5x10⁴个/mL接种于25c㎡培养瓶，每孔5mL，实验分组同上。24 h后更换条件培养液，分别在条件培养48，72h后，采用Western-blot法测定细胞内Runx2蛋白的表达。利用IP细胞裂解液提取细胞内蛋白质，BCA法进行蛋白质定量，取蛋白质40μg与上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min后，进行SDS-PAGE电泳（5%分离胶约1.5h，12%积层胶约4.5h）。结束后小心剥下凝胶，在转膜液中制作转膜“三明治”，由阴极到阳极依次：一张海绵、三层滤纸、凝胶、硝酸纤维素薄膜、三層滤纸、一张海绵。电压30V，转膜过夜（16～18h）。蛋白质封闭后加入一抗兔抗大鼠Runx2（1：200）、actin（1：200）孵育。然后加入二抗HRP-羊抗兔IgG（1：1000）孵育。加入显色液即可出现目的蛋白条带，数码相机拍照，利用Image J 2X软件进行分析，将特定蛋白的光密度与]actin蛋白的光密度的比值作为评价该特定蛋白表达水平的指标。

2.5统计学分析每个实验均重复3次，实验测得数据以x±s表示。实验数据采用SPSS16.0软件进行t检验，P<0.05差异有统计学意义，P<0.01差异性显著。

3结果

3.1SPC-I对ROS1728细胞增殖的影响SPC-I对ROS1728细胞的生长增殖均起到抑制作用，作用强度也是有剂量区别的，见图1。SPC-I 2.5 g·L^-1组抑制作用较强，与对照组相比差异性显著（P<0.01）；5 g·L^-1组抑制作用极弱，与对照组相比无差异性；10 g·L^-1组抑制作用较轻，与对照组相比有差异性（P<0.05）；而阳性对照组对ROS1728细胞增殖起到显著的促进作用，与对照组相比较差异性显著（P<0.01）。

3.2SPC-I对ROS1728细胞标志基因的影响

大鼠成骨样细胞ROS1728分化标志基因ALP，Coll-I，OC mRNA的表达均出现与引物相一致的条带，各实验组的表达存在差异，但表达结果也趋于一致，见图2。SPC-I 2.5，10 g·L^-1组各标志基因的表达量降低，与对照组相比差异性显著（P<0.01）；5 g·L^-1组各标志基因的表达量增加，与对照组相比差异性显著（P<0.01）；阳性对照组各标志基因的表达量增加，与对照组相比有差异性（P<0.05）。5 g·L^-1组作用48，72 h呈现出时间依赖性。

3.3 SPC-I对ROSl728细胞转录调控基因的影响

大鼠成骨样细胞ROS1728分化特异性的转录因子Runx2，osterix mRNA的表达均出现与引物相一致的条带，各实验组的表达存在差异，但表达结果也趋于一致，见图3。SPC-I 2.5，10 g·L^-1组各标志基因的表达量降低，与对照组相比差异性显著（P<0.01）；5 g·L^-1组各标志基因的表达量增加，与对照组相比差异性显著（P<0.01）；阳性对照组各标志基因的表达量增加，与对照组相比有差异性（P<0.05）。5 g·L^-1。浓度组作用48，72h呈现出时间依赖性。

3.4SPC-I对ROSl728细胞转录调控蛋白的影响

Western-blot结果显示，大鼠成骨样细胞ROSl728分化特异性的转录因子Runx2蛋白的表达，SPC-I2.5，10 g·L^-1组Runx2蛋白的表达量降低，与对照组相比差异性显著（P<0.01）；5 g·L^-1组Runx2蛋白的表达量增加，与对照组相比差异性显著（P<0.01）；阳性对照组Runx2蛋白的表达量增加，与对照组相比有差异性（P<0.05）；5 g·L^-1组作用48，72h呈现出时间依赖性，见图4。

4讨论

骨组织是构成骨骼的主要成分，主要由骨基质和细胞构成。其中骨基质主要是由成骨细胞合成的细胞外基质经矿化而成，由有机成分和无机质构成。无机基质由阳离子（钙、镁、钠、钾、锶）、阴离子（硫化物、磷、氯化物）和羟基磷灰石等构成，提供骨骼硬度和压力；有机成份以I型胶原为主，还包括骨钙素、骨桥蛋白、纤维连接蛋白及层连蛋白等无定形基质，其中胶原纤维提供骨骼支撑和张力。近年来发现骨细胞的胞外基质在成骨细胞增殖、分化等过程中起着重要的作用。骨的细胞类型主要包括骨原细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞。

本实验选用大鼠骨肉瘤成骨样细胞系（ROS1728）作为研究对象。ROS1728是国际上公认并通用的由大鼠来源的成骨样细胞系，来源可靠，具有正常成骨细胞的许多表型特征和成骨细胞的多种功能，其增殖在某种程度上可反映成骨细胞的增殖，可以用来观察成骨细胞的增殖和分化，检测成骨细胞成熟过程中细胞外基质的形成及分子生物学的机制。而且其体外传代和培养特性可以保持相对稳定，各实验指标重复性好，经常被用来替代成骨细胞进行试验研究。本实验观察到细胞的形态、生长方式和增殖特性符合成骨样细胞系的特点，从ROS1728细胞生长曲线可见，SPC-I对成骨细胞生长增殖均起到抑制作用，抑制程度与药物浓度密切相关。SPC-I2.5 g·L^-1组抑制程度较强，10g·L^-1组抑制程度较弱，5g·L^-1组抑制作用不明显与对照组相当，而阳性对照地塞米松则显著促进增殖。

在成骨细胞分化过程中，多种成骨细胞特异性基因如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、I型胶原蛋白（collagen type I，Coll-I）、骨钙素（osteocal.cin，OC）等会在不同时期陆续表达，产生相应的蛋白分泌到细胞外基质，从而实现细胞外基质的矿化、矿化结节的形成，进而完成成骨，形成富含矿物质的骨组织。ALP是一种能够将对应底物去磷酸化的酶。通过水解磷酸单酯将基质胶原蛋白分子上的磷酸基团去除，生成磷酸根离子和自由的羟基，增加局部无机磷酸浓度，为骨组织内羟基磷灰石结晶的形成提供条件，同时水解焦磷酸盐，解除对骨盐形成的抑制作用、促进矿化，从而启动细胞外基质矿化和钙磷沉积的过程。因而，ALP是细胞外基质成熟的早期标志，在细胞外基质合成期开始出现，钙化期达高峰。ALP随着细胞分化的进展而表达增强，因此其活性是成骨细胞分化功能的重要指标之一，可以间接反映成骨细胞的功能。Coll-I是骨基质中含量最多的蛋白，占骨基质有机物的80%～90%，Coll-I是构成骨组织的蛋白框架，是钙盐沉着以及细胞附着的支架。它的合成分泌是骨组织形成的先决条件，是成骨细胞向基质成熟方向分化的标志。加速其合成分泌起到促进骨组织矿化的作用，是成骨细胞分化最早的标志。OC又称骨y-羧基谷氨酸蛋白或骨依赖维生素K蛋白，是成骨细胞特异合成和分泌的一种非胶原蛋白，该基因只有在矿化期开始后才会被诱导表达。主要表达于成骨细胞，OC对钙和羟基磷灰石都有很高的亲和力，会随着成骨细胞矿化和分化的进展而增加，当骨钙结节成熟后表达达到高峰。OC作为成骨细胞分化成熟的中晚期标记物之一，是继ALP表达之后成骨细胞又一个特征性的蛋白质，是成骨细胞进入矿化期主要指征之一，可反映成骨细胞的成骨功能。

本实验结果显示，SPC-I对ROS1728细胞分化标志基因ALP，Coll-I，OC的影响也是有浓度区别的，表达结果也趋于一致。SPC-I 2.5，10 g·L^-1组各标志基因的表达量降低，可能是抑制2种成骨细胞的增殖，使成骨细胞数减少，也可能抑制成骨细胞的功能，使标志基因的表达量减少。SPC-I5 g·L^-1組各分化标志基因的表达量增加，虽然它不能使成骨细胞增殖，但可以促进成骨细胞的功能旺盛，使标志基因的表达量增加。研究表明，细胞的分化和增殖是不能共存的，以增殖态为主的细胞其功能低下，以功能态为主的细胞其增殖力弱。因增殖旺盛的细胞阻碍分化，若想诱导细胞分化，需要抑制细胞增殖。本实验SPC-I5 g·L^-1组不促进细胞增殖，而使得细胞的功能增强与之相一致，并且5g·L^-1组作用48，72h呈现出时间依赖性。

成骨细胞标志基因的表达受多种因素的调节，其中Runx2，osterix转录调控因子的影响最为显著。Runx2（runt relatedgene-2，Runt相关基因-2）又称Cbfal，属于Runt/Cbfa转录因子家族。Runx2是一个多功能转录因子，相对分子质量55kDa，它可以通过调节软骨细胞和成骨细胞的分化以及许多细胞外基质蛋白基因的表达，来控制骨的发育。研究发现Runx2是一种正性调节因子，可以驱动成骨前体细胞转化为成熟的成骨细胞并形成骨基质；可以通过与骨基质蛋白的启动子结合，上调骨基质蛋白的表达，如Coll-I，OC，骨桥蛋白。在成熟的成骨细胞中，Runx2表达虽然低，但对维持成熟成骨细胞的Coll-I和OC的表达不可或缺。osterix是2002年由Nakashima等发现的只在发育骨组织中特异性表达的一种转录因子。它由428个氨基酸组成，相对分子质量46 kD。osterix的C末端存在3个锌指型DNA结合区域，和一个富含脯氨酸和丝氨酸的转录激活区域。因此，sterix可作为一种新的具有典型转录因子结构特征的多肽。研究发现，缺乏os-terix基因的小鼠缺乏成骨细胞，没有软骨内成骨和膜内成骨。同时成骨细胞分化的各种标志物的表达水平也降低，如Coll-I，OC，骨桥素，骨涎蛋白等，提示osterix是成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的关键物质。osterix位于Runx2的下游参与调控成骨细胞的生成。

本实验检测结果显示，SPC-I5g·L^-1组能够促进ROS1728细胞特异性转录因子Runx2，osterixmRNA的表达，与标志基因ALP，Coll-I，OC mRNA的表达结果相一致，并且呈现出时间依赖性。SPC-I5 g·L^-1组能够促进ROS1728细胞特异性转录因子Runx2蛋白的表达，并且呈现出时间依赖性。

本实验表明SPC-I5 g·L^-1组首先使在成骨分化的调节因子中处于核心地位的Runx2基因表达，Runx2蛋白激活其下游的osterix基因，然后与标志基因上成骨细胞特异性顺式作用元件2（OSE2）相结合，促进成骨细胞标志基因ALP，Coll-I，OC mRNA的表达，从而生成丰富的骨胶原基质，通过基质矿化而形成新的骨组织。成骨细胞继而被埋于骨基质中成为骨细胞，促进骨细胞的形成。因此SPC-I 5g·L^-1组轻度抑制成骨样细胞ROSl728的增殖，但可强烈促进ROS1728细胞功能增强，通过调控Runx2基因的表达，促进ROS1728细胞分化、成熟。本实验为SPC-I成为抗骨质疏松药物的开发提供理论依据。

成骨细胞分化过程各种标志物程序性表达，是多种通路调控靶基因转录活性使细胞内外、核内外信号交流的结果。