毛冬青总黄酮对小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型的影响

曹利华+郑雁+辛卫云+徐坤+苗明三

[摘要]采用小鼠连续注射地塞米松复制血瘀模型，并给予相应药物，连续灌服15d后，阻断双侧颈总动脉血流10min，恢复灌注5d后，再次阻断双侧颈总动脉30min。再灌注24h，复制小鼠脑缺血耐受模型。取血测全血黏度；断头取脑，一半脑置于10%福尔马林溶液中固定，用于HE染色；另一半脑用生理盐水制备脑匀浆，用于测定脑组织匀浆中ATPase活力、GLU含量、脑匀浆中NOS表达；探讨毛冬青总黄酮对小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型的保护作用机制。结果显示，与缺血耐受组（模型组）比较，高剂量毛冬青总黄酮组能够显著降低小鼠血流变高、中、低切值（P<0.01），中、低剂量毛冬青总黄酮组能够显著降低小鼠血流变低切值（P<0.01），明显减轻小鼠血流变中切值（P<0.05），中剂量毛冬青总黄酮组能够明显降低小鼠血流变高切值（P<0.05）；高剂量毛冬青总黄酮能够显著升高各ATPase活力（P<0.01），中剂量毛冬青总黄酮能够显著增强Na⁺-K⁺-ATPase活力（P<0.01），低剂量毛冬青总黄酮能够明显升高Na⁺-K⁺-ATPase活力（P<0.05）；高剂量毛冬青总黄酮能够显著降低Glu含量（P<0.01），其他给药剂量能够明显降低Glu含量（P<0.05）；高剂量毛冬青总黄酮组可显著降低小鼠脑组织中TNOS，iNOS的水平（P<0.01），中剂量毛冬青总黄酮组可明显降低小鼠脑组织中TNOS，iNOS的水平（P<0.05），低剂量毛冬青总黄酮组可明显降低小鼠脑组织中iNOS的水平（P<0.05）；各剂量毛冬青总黄酮均可改善脑组织病理改变。提示毛冬青总黄酮可从降低全血黏度、抑制炎症介质NOS的表达、降低Glu含量、升高ATPase活力、改善缺血脑部组织病理方面保护小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型的脑损伤。

[关键词]毛冬青总黄酮；血瘀合并脑缺血耐受模型；机制

毛冬青为冬青科冬青属植物Ilex pubescensHook.et Am.的干燥根，生于山坡灌木丛中，是我国南方常用中药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效。研究表明，毛冬青可增加冠脉血流量、降低冠脉阻力，可增加脑血流量、降低脑血管阻力，对冠脉血管及脑血管均有一定的扩张作用。毛冬青中含有黄酮类成分、酚性成分、香豆素类、二萜类成分、甾醇、鞣质、糖类及氨基酸多种化学成分，主要成分是毛冬青黄酮苷和总皂苷。本实验通过复制小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型，观察毛冬青总黄酮对小鼠脑缺血后全血黏度、脑组织能量代谢，脑匀浆中NOS表达、GLU含量及脑部组织形态学的影响，探讨其脑保护作用的特点及可能机制。

1材料

毛冬青总黄酮（质量分数52%，由河南中医学院分析化学实验室提供，批号20100627）；华佗再造丸（广州奇星药业有限公司，批号7438）；尼莫地平（山東新华制药股份有限公司，批号0808170）；地塞米松磷酸钠注射液（DX）（江苏涟水制药有限公司，批号0912253）；氯化钠注射液（郑州永和制药有限公司，批号10062121）；水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批号2010302）；甲醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20100601）；ATP（adenosine-triphosphate）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100719）；Glu（glutamicacid）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100719）；NOS（nitric oxide synthetase）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100717）；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20100717）。

LBY-N6A型旋转式血液黏度计（北京普利生集团）；72-1分光光度计，75-2分光光度计（上海第三分析仪器厂）；玻璃匀浆器（上海玻璃仪器厂）；恒温水浴锅（北京市光明仪器厂）；离心机（北京医疗仪器修理厂）；可调式移液器（上海雷勃分析仪器有限公司）。

Wistar小鼠，昆明种，清洁级，雄性，体重25～30g，由河北省实验动物中心提供，合格证编号1006135。

2方法

2.1造模及给药取小鼠144只，随机分为9组，每组16只，分别为毛冬青总黄酮高、中、低剂量组（0.2，0.1，0.05 g·kg^-1；10，5，2.5 g·L^-1），尼莫地平片组（0.02 g·kg^-1，l g·L^-1），华佗再造丸组（1.33 g·kg^-1，66.5 g·L^-1），缺血再灌注损伤组，缺血耐受组（模型组），血瘀假手术组，非血瘀假手术组。从每天后腿肌肉注射地塞米松造血瘀模型开始给药，每日1次，连续20d，缺血再灌注损伤组、缺血耐受组、血瘀假手术组、非血瘀假手术组给予相同体积的0.1%CMC混悬液。所有小鼠灌胃体积均为0.02 mL·g^-1，其中，所有药物用0.1%CMC溶液配制。

非血瘀假手术组注射同体积生理盐水，其余8组，每天给药1次，同时每天后腿肌肉注射地塞米松0.8 mg·kg^-1（0.01 mL·g^-1），连续给药15d，禁食12h后，10%水合氯醛麻醉，仰卧固定于手术台上，颈前正中切口，钝性分离双侧颈总动脉。除假手术组和缺血再灌注损伤组外，其余各组均用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉10min作为预处理，然后恢复灌流，假手术组和缺血再灌注损伤组只暴露双侧颈总动脉，不做预处理，所有小鼠继续灌药5 d，第5天给药后1 h，再次经10%水合氯醛0.003 mL·g^-1腹腔麻醉，暴露双侧颈总动脉，除假手术组外其余各组均用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉30min后进行再灌注并缝合，假手术组只暴露颈总动脉，但不阻断血流。术中维持环境温度25～26℃。

2.2指标检测所有小鼠于末次手术24h，统计死亡率后，摘眼球取血1mL，测全血黏度；处死小鼠，迅速剥取脑组织，冠状切取视交叉后脑组织，10%甲醛溶液固定，用于HE检测，观察脑组织形态学变化；准确称取剩余脑组织质量，按质量体积比加生理盐水制备成10%的脑组织匀浆，匀浆液经2300r·min^-1，4℃离心10min，取上清液至-70℃冰箱冻存，按照试剂盒操作说明测定脑组织蛋白含量、AT.Pase活力、Glu浓度、NOS活力测定。

2.3数据分析数据分析用SPSS17.0统计软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析；等级资料采用Ridit检验。

3结果

3.1對小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型血液流变学的影响与缺血再灌注损伤组相比，缺血耐受组、华佗再造组、中剂量毛冬青总黄酮组死亡率降低；尼莫地平组，高、低剂量毛冬青总黄酮组大鼠死亡率明显降低；与非血瘀假手术组比较，血瘀假手术组小鼠全血流变高、中、低切值显著升高（P<0.01），说明该剂量地塞米松可以造成小鼠血瘀模型；与血瘀假手术组比较，缺血再灌注损伤组全血流变值没有明显变化，而缺血耐受组（模型组）全血黏度中切、高切值显著升高（P<0.01），说明手术对其刺激可使血瘀程度进一步加重；与缺血再灌注损伤组比较，缺血耐受组（模型组）全血流变中切、高切值变化明显（P<0.05）；与缺血耐受组（模型组）比较，华佗再造丸组能够明显降低小鼠全血流变中切值（P<0.05），尼莫地平组能显著降低小鼠全血流变低、中、高切值（P<0.01）；高剂量毛冬青总黄酮组能够显著降低小鼠血流变高、中、低切值（P<0.01），中、低剂量毛冬青总黄酮组能够显著降低小鼠血流变低切值（P<0.01），明显减轻小鼠血流变中切值（P<0.05），中剂量毛冬青总黄酮组能够明显降低小鼠血流变高切值（P<0.05），说明给予毛冬青总黄酮后，血液粘滞程度与给药剂量大小成反相关。结果见表1。

3.2对小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型脑能量代谢的影响与非血瘀假手术组比，血瘀假手术组ATP酶活力没有显著改变，说明造血瘀模型并不能明显改变脑组织能量代谢；与血瘀假手术组比，缺血再灌注损伤组、缺血耐受组（模型组）ATPase活力显著降低（P<0.01），说明脑缺血可以降低脑组织的能量代谢；与缺血再灌注损伤组比，缺血耐受组（模型组）ATPase活力升高不明显，与缺血耐受组（模型组）比，华佗再造丸能够明显增强Na⁺.K⁺ATPase，Mg²⁺-.ATPase活力（P<0.05），显著增强Ca²⁺-ATPase活力（P<0.01）；尼莫地平、高剂量毛冬青总黄酮能够显著升高各ATPase活力（P<0.01），中剂量毛冬青总黄酮能够显著增强Na⁺.K⁺.ATPase活力（P<0.01），低剂量毛冬青总黄酮能够明显升高Na⁺K⁺-ATPase活力（P<0.05），表明毛冬青总黄酮对小鼠血瘀合并脑缺血耐受动物模型的ATPase活力有改善作用。以高剂量毛冬青总黄酮提高小鼠血瘀合并脑缺血耐受动物模型脑匀浆中ATPase活力为强。结果见表2。

3.3对血瘀合并脑缺血小鼠脑组织Glu含量，NOS活力的影响

与非血瘀假手术组比，血瘀假手术组小鼠脑组织Glu含量、NOS活力没有显著变化；与血瘀假手术组比，缺血再灌注损伤组Glu含量、TNOS，iNOS活力显著升高（P<0.01），缺血耐受组（模型组）Glu含量明显升高（P<0.05），而TNOS，iNOS活力显著升高（P<0.01），说明脑缺血使兴奋性氨基酸大量释放、增加自由基的释放；与缺血再灌注损伤组比，缺血耐受组（模型组）Glu含量、NOS活力明显降低（P<0.05），说明给予缺血预处理可以降低再次脑缺血造成的兴奋性氨基酸的过量释放、减轻再次缺血所引起的脑组织细胞大量释放自由基，从而减轻了大量自由基对脑细胞的损伤；与缺血耐受组（模型组）比，华佗再造丸、高剂量毛冬青总黄酮能够显著降低Glu含量、TNOS，iNOS的水平（P<0.01），其他给药剂量能够明显降低Glu含量（P<0.05）；尼莫地平组显著降低iNOS的水平（P<0.01）、明显降低TNOS水平（P<0.05），中剂量毛冬青总黄酮组可明显降低小鼠脑组织中TNOS，iN.OS的水平（P<0.05），低剂量毛冬青总黄酮组可明显降低小鼠脑组织中iNOS的水平（P<0.05）；高、中剂量毛冬青总黄酮对小鼠血瘀合并脑缺血耐受动物模型脑匀浆中NOS表达作用具有优势；高剂量毛冬青总黄酮能够减轻再次大缺血造成的脑组织谷氨酸大量释放，显著诱导脑缺血耐受产生，作用较优。结果见表3。

3.4对小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型脑组织海马区组织形态的影响

非血瘀假手术组动物海马CA1区脑神经细胞基本正常；缺血耐受组（模型组）动物海马CA1区大部分脑神经细胞基本正常，少数萎缩；血瘀假手术组动物海马CA1区脑神经细胞基本正常；缺血再灌注损伤组动物海马CA1区脑神经细胞明显萎缩；尼莫地平组动物海马CA1区脑神经细胞基本正常；华佗组动物海马CA1区脑神经细胞部分萎缩；高剂量毛冬青总黄酮组动物海马CA1区脑神经细胞基本正常；中剂量毛冬青总黄酮组动物海马CA1区脑神经细胞部分萎缩；低剂量毛冬青总黄酮组动物海马CA1区脑神经细胞明显萎缩。结果见图1，表4。

经Ridit检验，与假手术组相比，缺血耐受组（模型组）、缺血再灌注组有显著的统计意义（P<0.01），说明造模成功。与缺血耐受组（模型组）相比，高、中剂量毛冬青总黄酮组和阳性对照药尼莫地平组可显著减轻脑组织的病理损伤程度（P<0.01），低剂量毛冬青总黄酮组有明显的统计学意义（P<0.05）；与缺血再灌注组相比，缺血耐受组（模型组），高、中、低剂量毛冬青总黄酮组和阳性对照药组差异显著（P<0.01），高、中剂量毛冬青总黄酮对血瘀合并脑缺血小鼠脑组织病理改变较为优越。

4讨论

临床上血栓的形成是导致缺血性脑血管病的一个重要原因，祖国医学认为活血化瘀是治疗脑缺血疾病主要方法和治则。因此，建立与临床病症相似的病症模型，能够更好地阐明脑缺血耐受的产生及产生机制。根据实验室前期研究结果，本研究所采用的血瘀合并脑缺血耐受模型是在血瘀的基础上造成的，缺血程度适宜，手术方法简单，模型成功率高，动物死亡较少，且与临床特征较吻合，更适合用于中药防治缺血性脑血管病的研究。

脑缺血耐受现象（brain ischemic tolerance，BIT）是指预先短暂性缺血或轻度缺氧激发或动员机体内在的防护能力，使机体对随后严重的缺血、缺氧产生防御和保护作用的现象。脑缺血耐受的机制至今还不很明確。研究表明，耐受涉及递质、受体、通道、基因表达、蛋白质合成的多环节调控的复杂生物学过程。某些中药提取物能够提高脑缺血耐受性。毛冬青中含有黄酮类成分、酚性成分、香豆素类、二萜类成分、甾醇、鞣质、糖类及氨基酸多种化学成分，其主要成分是毛冬青黄酮苷和总皂苷。毛冬青总黄酮是从冬青属植物毛冬青的干燥根中提取出来的一类有效成分，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善血流动力学及抑制平滑肌增生等作用。

脑缺血缺氧后，脑组织内NOS表达上调，产生了大量具有神经毒性的NO、自由基，损伤细胞膜和线粒体呼吸酶，导致神经元死亡及脑组织损伤。NOS也是一重要的炎症介质，多在免疫应答和神经损伤后才表达。研究表明，给予p38MAPK抑制剂可减少脑组织内NOS表达，从而减少脑梗死体积。目前发现的NOS有3类：神经元型（nNOS）、内皮型（eNOS）和诱导型（inducible NOS，iNOS），其中iNOS在正常组织中未见表达，只有在细胞受到刺激后其表达呈现，可持续产生大量NO。抑制iNOS能够改善神经功能评分，降低死亡率，减少脑梗死体积比，衰减的形态变化在皮层神经元，降低缺血再灌注损伤的严重程度。这些也在一定程度上说明炎症免疫反应参与了脑梗死所致的脑组织损伤，而NOS是启动脑梗死后炎症免疫反应的重要介质。NOS过量表达可造成自由基的大量释放，产生神经毒性，损伤细胞膜和线粒体呼吸酶，导致神经元死亡及脑组织损伤。缺氧激活KATP通道，可以减轻海马神经元的去极化，并可对谷氨酸兴奋毒性所致的神经元损伤起到保护作用。HE染色是脑组织病理改变最直观的观察方法，通过观察其病理改变，可以直接说明药物作用的强弱。

本实验结果表明，小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型复制成功，毛冬青总黄酮能改善地塞米松导致的血瘀程度，使小鼠血瘀合并脑缺血耐受模型的全血黏度降低，使血液流变得以改善；通过抑制炎症介质NOS的表达，降低再次大缺血时对脑组织的损伤，起到脑缺血耐受作用；减轻自由基对脑细胞的损伤，保护细胞膜和线粒体呼吸酶；并可对谷氨酸兴奋毒性所致的神经元损伤起到保护作用，且治疗效果显著。