交泰丸干预对氯苯丙氨酸致大鼠失眠的代谢组学研究

岳贺+周祥羽+李春苑+邹忠杰+王淑美+梁生旺+龚梦鹃

[摘要]为了阐明交泰丸干预对氯苯丙氨酸致大鼠失眠的药效及作用机制，SD大鼠一次性腹腔注射PCPA建立失眠模型，试验期间观察大鼠自发活动变化，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清神经生长因子（nerve growth factor，NGF）水平，并利用核磁共振氢谱（H-NMR）代谢组学技术建立大鼠血清及海马组织代谢物谱，分析交泰丸干预下大鼠自发活动，NGF水平及与失眠相关潜在生物标志物的变化。结果显示交泰丸能明显抑制失眠大鼠的自发活动，显著升高失眠大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清中NGF水平。交泰丸能对失眠所致大鼠血清和海马组织代谢紊乱产生有效的干预，并分别对血清和海马组织中6种和5种与失眠相关潜在生物标志物产生显著的回调。研究表明交泰丸干预PcPA所致失眠的机制可能与调节NGF水平及调控机体氨基酸代谢、脂质代谢和胆碱代谢有关。

[关键词]

交泰丸；失眠；代谢组学；核磁共振；对氯苯丙氨酸

失眠是一个严重的健康问题，随着现代社会心理压力增加，失眠发病率逐年升高，因此提高睡眠质量对公众健康有着重要意义。交泰丸记载于明代《韩氏医通》，由黄连和肉桂10：1配伍而成，方中黄连大寒大苦，清泄亢盛之心火，肉桂辛甘大热，助阳补火，两药配伍交通心肾，对心肾不交型不寐具有显著效果。全世建等研究显示交泰丸治疗失眠的机制与调节下丘脑.垂体.肾上腺轴（HPA轴）的功能以及相关神经递质如促肾上腺皮质激素（ACTH）、促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、肾上腺分泌的皮质酮（CORT）、5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）和肾上腺素（E）有关。

代谢组学采用自上而下的策略，将机体作为一个整体性的系统，从代谢网络的终端症状反映机体状况，阐明药物靶点相关干预。目前尚未见交泰丸治疗失眠代谢组学研究的报道。本研究采用H-NMR代谢组学方法探讨对氯苯丙氨酸（p-chlorophe.nylalanine，PCPA）致失眠及交泰丸干预下大鼠血清及海马组织的代谢指纹谱变化，阐明交泰丸干预失眠药效及作用机制。

1材料

1.1实验动物雄性SD大鼠，180～200 g，购自中山大学实验动物中心，SPF级，许可证号SCXK（粤）2011-0029。

1.2药品与仪器黄连和肉桂饮片购自广州采芝林大药房，经广东药科大学中药学院韩彬教授鉴定为正品；PCPA甲酯盐酸盐购自嘉兴思诚化工有限公司（批号MAYA-CR-912，纯度>98%）；蛋白含量测定和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制剂Cocktail购自美国Biotool公司；磷酸盐缓冲液（PBS）和氘水（D：0）均购自美国Sigma公司；ELX.808酶标仪（美国BioTek公司）；Bruker AVANCEⅢ500 MHz全数字化超导核磁共振谱仪（瑞士Bruker公司）；UV-2401.PC型紫外.可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.3交泰丸水提液的制备精确称取适量黄连、肉桂，以黄连和肉桂10：1混合，加10倍量水，浸泡1h，煎煮2次，每次1h，合并2次滤液，水浴浓缩至生药浓度0.5 g·mL^-1。

2方法

2.1模型建立及给药方法

参考文献方法，将36只雄性SD大鼠置于12h光照和12h黑暗环境（温度22℃，相对湿度50%）下自由饮食。适应3d后随机分正常组、模型组和交泰丸组。交泰丸组灌胃交泰丸水提液（5 g·kg^-1），每天1次，连续5d，对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。实验第3天，模型组和交泰丸组一次性腹腔注射PCPA甲酯盐酸盐（564 mg·kg^-1，相当于PCPA 450 mg·kg^-1）建立失眠模型，正常组一次性腹腔注射等体积生理盐水。末次给药3h后，每组一半动物用于测量下丘脑、海马、前额叶皮质和血清NGF水平，另一半动物用于血清及海马组织代谢组学分析。

2.2大鼠自发活动试验试验开始前将大鼠置于干净的饲养笼中提前适应3min，记录各组大鼠2min内自发活动时间和前肢离地举立次数作为正常活动反应指标。末次给药后1h再次测量各组大鼠上述指标。

2.3大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清采集、处理及NGF水平检测大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，收集的血液样品经凝固（4℃，60min）后离心（3500 r·min～，15min，4℃）得到血清。冰上分离出大鼠下丘脑、海马和前额叶皮质，用冰冷的生理盐水冲洗，滤纸拭干称重。各部分脑组织加入9倍量PBS（含1%蛋白酶抑制剂Cock.tail）冰水浴中匀浆，离心（3500 r·min^-1，15²in，4℃）得到上清液。血清和组织上清液按试剂盒说明书操作进行NGF指标检测，并采用考马斯亮蓝法（Bradford法）测定组织样品蛋白含量。数据以x±s表示，采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，多组均数间的两两比较采用Tukey检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2.4大鼠血清、海马组织采集、处理及H-NMR测定大鼠乙醚吸入麻醉后眼眶后静脉丛取血，收集的血液样品经凝固（4℃，60min）后离心（3500r·min^-1，15min，4℃）得到血清，将400μL血清加入到5mm NMR测试管中，然后加入50μL磷酸缓冲液（0.2mol·L^-1Na₂HP04-0.2 tool·L^-1振蕩混匀，待测。冰上分离出大鼠海马组织，在冰水浴中用50%乙腈溶液匀浆（5 mL·g^-1海马组织），离心（12 000 r·min^-1，10min，4℃）后取上清液750μL冻干，冻干物用450μL磷酸缓冲液（0.2 tool·L^-1磁管中。endprint

H-NMR测试时，实验温度为298 K，血清样本采用Carr-Purcell-Meibom-Gill（CPMG）脉冲序列抑制血清中蛋白质及脂蛋白较宽的共振信号，总的回波时间100ms，弛豫延迟时间4s，采样时间3.28 s。海马组织样本采用预饱和的DNOESY脉冲序列压制水峰，弛豫延迟时间2s，采样时间1.64 s。血清和海马组织样本谱宽10kHz，采样点数64 K，采集次数128次。

2.5H-NMR图谱处理及多变量数据分析采用线宽为0.3 Hz的指数窗函数进行傅立叶变换。采用软件MestReNova 6.1（西班牙Mestrelab Research公司）对所获谱图进行手动相位和基线校正后，对血清和海马组织样本，分别参照乳酸的甲基共振双重峰）和TSP对H-NMR谱的化学位移进行定标。在6 0.5～9.5区域按0.01等间隔分段积分，对于血清和海马组织样本，分别将区域64.68～5.22，6 4.53～5.30设为0积分段。然后将图谱积分值输出到Excel 2010（Microsoft Inc，Belle.vue，WA）中，对各分段积分值进行归一化处理。归一化所得数据乘以1万后导入SIMCA-P12.0（Umetrics AB，Umea，Sweden），经Pareto标度化预处理后，进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonalpartial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）。

3结果

3.1交泰丸对大鼠自发活动的影响试验开始前各组大鼠自发活动时间和前肢离地举立次数没有明显差异。末次给药后1h，与正常组相比，模型组大鼠2min内自发活动时间和前肢离地举立次数明显增加（P<0.05），与文献报道一致，表明失眠模型建立成功。交泰丸组较模型组自发活动明显减少（P<0.05），表明交泰丸能明显抑制失眠大鼠自发活动，见表1。

3.2交泰丸对失眠大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清NGF水平的影响与正常组比较，模型组大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清中NGF水平均显著性降低（P<0.05）；与模型组比较，交泰丸组大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清中NGF水平均显著性升高（P<0.05），表明交泰丸能显著回调失眠引起的大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清中NGF水平的降低，提示交泰丸能通过调节NGF水平来有效干预失眠，见表2。

3.3血清和海马组织的H-NMR代谢物谱分析大鼠血清和海马组织的H-NMR见图1，2。代谢物谱峰的归属主要是依据化学位移值、峰的裂分隋况、耦合常数及参考文献报道。

3.4PCPA致失眠模型大鼠血清和海马组织代谢指纹谱的变化对照组和模型组的血清和海马组织样本点在PCI维可以完全区分开，说明PCPA诱导失眠后大鼠机体生理及物质代谢状况已经发生了明显的改变。本研究采用7倍交叉验证法分别对OPLS-DA模型的可靠性进行验证，得到了OPLS-DA模型的主要参数，血清：海马组织。

从上述参数可以看出本研究建立的模型具有较高的可靠性，结果见图3A，B。

3.5表征代谢物谱差异的潜在生物标志物本研究使用OPLS-DA模型中变量重要性投影（variableimportance in the projection，VIP）参数评价潜在的生物标志物。选取VIP>1的差异变量，再用t检验对筛选到的差异变量在对照组和模型组间进行验证，只有P<0.05的差异变量才被认为是潜在的生物标志物。按照上述原则，最终在血清和海马组织中分别筛选得到8种和7种具有显著差异的化合物，见表3，4。

3.6交泰丸对PCPA致失眠模型大鼠血清和海马组织代谢紊乱的干预作用交泰丸组样本点与模型组样本点可以完全分离，且与正常组样本点接近，表明交泰丸能有效干预失眠。同时，交泰丸能分别使失眠大鼠血清和海马组织中6种和5种潜在生物标志物显著性回调（表3，4）。从上述结果可以看出交泰丸能对PCPA失眠模型大鼠血清和海马组织代谢紊乱产生有效的干预作用。

4讨论

PCPA诱导的大鼠失眠模型是目前被广泛接受的用来研究失眠机制和药效评价的模型之一。PC.PA可以选择性作用于色氨酸羟化酶，抑制大鼠大脑5.HT合成，造成睡眠昼夜节律消失，几乎达到完全失眠。本研究中模型组较正常组大鼠自发活动显著增加，表明失眠模型建立成功。同时，失眠大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清中NGF水平均显著降低，并利用代谢组学技术分别从大鼠血清和海马组织中筛选出8种和7种与失眠有关的潜在生物标志物。

NGF广泛存在于参与睡眠.觉醒的胆碱能神经元中，由海马和脑皮质产生的NGF可通过胆碱能神经逆行运输至前脑基底核，维持胆碱能神经元的存活和功能，NGF水平的降低会导致快动眼睡眠时间减少，觉醒时间延长。其通过与神经元和轴突末梢的激酶受体结合，诱导快动眼睡眠，是快动眼睡眠产生和觉醒抑制作用机制的内在调节器。本研究中，模型组较正常组大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清的NGF水平均显著降低，提示NGF水平与失眠这一过程密切相关。同时，交泰丸能明显升高失眠大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清中NGF水平，说明交泰丸干预失眠的机制与调节NGF水平有关。

本研究通过代谢组学研究发现，失眠可引起机体氨基酸代谢紊乱，表现在模型组较正常组大鼠血清中谷氨酸、异亮氨酸水平升高，海马组织中Ⅳ_乙酰天冬氨酸、牛磺酸水平升高，丙氨酸、氨基丁酸（GABA）水平降低。谷氨酸对中枢神经系统神经元起兴奋作用，是主要的兴奋性递质，其释放的增加导致兴奋性神经毒性，在失眠中起重要作用。异亮氨酸属于支链氨基酸，可促进蛋白质合成、降低分解，同时通过减少色氨酸人脑的含量来降低5.HT的浓度，进而抑制、减缓中枢疲劳。牛磺酸通过作用于各种钙离子通道来降低谷氨酸介导的钙离子内流，稳定细胞膜，同时阻碍Bcl-2和Bax蛋白二聚体的形成，逆转Bcl-2/Bax比率，防止细胞凋亡。有研究显示异相睡眠剥夺会导致大脑皮质牛磺酸水平明显升高氨基丁酸是中枢神经系统中最主要的抑制性递质，能激活GABAa受体，使氯离子内流，形成抑制性突触后电位，有研究发现失眠时大鼠脑内GABA水平降低，给予交泰丸治疗能上调GABA水平。本研究中交泰丸能显著下调失眠大鼠血清中谷氨酸、异亮氨酸以及海马组织中牛磺酸水平，上调海马组织中丙氨酸、氨基丁酸水平，说明交泰丸干预失眠的机制与调节机体氨基酸代谢有关。

此外本研究还发现，失眠大鼠血清中低/极低密度脂蛋白、不饱和脂肪酸水平明显升高，说明失眠可引起机体脂质代谢紊乱，经交泰丸干预后，血清中低/极低密度脂蛋白回调趋近正常水平，说明交泰丸可通过调节脂质代谢来干预失眠。同时观察到失眠大鼠血清中胆碱、磷酸胆碱以及海马组织中甘油磷酸胆碱水平均显著升高，提示失眠大鼠机体胆碱代谢紊乱。胆碱是细胞磷脂和神经鞘磷脂的重要组成部分，是乙酰胆碱和磷脂酰胆碱的前体物质，乙酰胆碱与学习记忆和认知功能密切相关，而磷脂酰胆堿参与细胞膜的构成。交泰丸能显著回调失眠大鼠血清中胆碱、磷酸胆碱以及海马组织中甘油磷酸胆碱水平，说明交泰丸可调节胆碱代谢紊乱而发挥干预失眠的效果。

综上所述，交泰丸能明显抑制失眠大鼠自发活动，并通过回调失眠大鼠下丘脑、海马、前额叶皮质和血清中NGF水平来干预失眠。同时，交泰丸还能调节机体氨基酸代谢、脂质代谢和胆碱代谢达到干预失眠的效果。本研究以不同方法相互佐证、补充，系统研究交泰丸干预失眠的作用机制，为科学阐释中药理论与作用机制提供新思路。endprint