纳米二氧化硅对大鼠心肺的损伤作用及机制

陆 敏 孙湖泊 李 妍

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

纳米二氧化硅对大鼠心肺的损伤作用及机制

陆 敏 孙湖泊1李 妍

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

目的 探讨纳米二氧化硅对大鼠心肺的损伤作用及其分子机制。方法 成年雄性Wistar大鼠16只，随机分为对照组及纳米二氧化硅染毒组，通过气管滴注50 nm粒径的纳米二氧化硅构建大鼠染毒模型。染毒30 d后称重并计算大鼠脏器系数，苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠心、肺组织形态学变化，免疫组织化学法检测大鼠心、肺转化生长因子(TGF)-β1、 p-Smad2/3信号分子的表达活性。结果 与对照组相比，纳米二氧化硅染毒组大鼠脏器系数没有显著改变，HE染色可见纳米二氧化硅对大鼠心、肺组织损伤明显，免疫组织化学染色结果显示纳米二氧化硅染毒组大鼠心、肺TGF-β1阳性细胞数明显增加，而p-Smad2/3表达量在心组织中无明显改变，在肺组织中明显增高。结论 50 nm粒径的二氧化硅可引起大鼠心、肺组织损伤，其作用可能与TGF-β1信号分子的活化有关。

纳米二氧化硅；心肺损伤；转化生长因子β1

纳米二氧化硅颗粒因其纯度高、装载量大、分散均匀等特性，被广泛应用于橡胶、塑料、纤维材料、添加剂、润滑油及药物载体等产品的生产。实验证实，纳米二氧化硅对实验动物及细胞模型均具有明显的毒性作用〔1〕。Flaherty等〔2〕研究发现，纳米二氧化硅慢性暴露不仅能够引起小鼠肺泡巨噬细胞模型产生急性毒性效应，同时能够引起机体发生慢性炎症反应，并导致细胞中活性氧的生成。Okoturo-Evans等〔3〕通过MTT实验及流式细胞术等实验技术证实，纳米二氧化硅染毒能够导致A549肺上皮细胞中凋亡相关蛋白，如UCP2及calpain-12的表达量异常升高，提示纳米二氧化硅具有明确的细胞毒性作用。Musa等〔4〕研究显示，纳米二氧化硅能够引起人肺支气管上皮细胞BEAS-2B及小鼠的淋巴结细胞DNA损伤。本研究旨在探讨纳米二氧化硅对大鼠心肺的毒性作用及其引起心肺损伤的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 JEM-1011 型透射电镜(日本电子株式会社)，光学显微镜(Olympus，日本)，JA1203电子天平(上海精密科学仪器有限公司，中国)，低温高速离心机(Eppendorf，德国)，全自动梯度脱水机(Leica，德国)，纳米二氧化硅(阿拉丁，中国)，羟脯氨酸(HYP)试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)，p-Smad2/3、Smad2及Smad3抗体(Cell Signaling Technology，美国)，转化生长因子(TGF)-β1抗体(Abcam生物科技公司，美国)，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物分组和处理 健康SPF级雄性Wistar大鼠16只，体重(200±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(实验动物批准号：2011-x-072)。随机分为两组，每组8只。对照组大鼠气管滴注及灌胃生理盐水；染毒组大鼠采用非暴露式的气管滴注染毒及灌胃生理盐水，隔日染毒；共处理30 d。50 nm粒径的纳米二氧化硅作用浓度为10 mg/kg体重。

1.3 大鼠心、肺脏器系数检测 全部实验大鼠处死前称重，处死后迅速取出大鼠心及肺，生理盐水冲洗并用滤纸吸干水分，称重并计算脏器系数。脏器系数=(脏器湿重/体重)×100%。

1.4 大鼠心、肺组织形态学观察 对照组及染毒组大鼠心、肺用10%多聚甲醛固定24 h后，经梯度浓度的乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋后做常规石蜡切片，并进行苏木素-伊红(HE)染色，观察大鼠心、肺组织细胞形态学变化。

1.5 大鼠心、肺TGF-β1、 p-Smad2/3信号分子活性检测 免疫组化法检测大鼠心、肺细胞中TGF-β1、p-Smad2/3的表达情况。心、肺组织切片后分别按照免疫组织化学染色的步骤进行不同信号分子的抗体孵育及染色过程，显微镜下观察相应切片，并对每个400倍视野下的阳性细胞数进行计数。

1.6 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1 大鼠心、肺脏器系数检测 脏器系数是实验动物某脏器的重量与其体重的比值数，正常时各脏器与体重的比值比较恒定。与对照组(心系数0.360 7%，肺系数0.523 3%)相比，10 mg/kg体重的纳米二氧化硅暴露对于大鼠心系数(0.359 3%)及肺系数(0.498 1%)均没有明显影响。

图1 纳米二氧化硅对大鼠心、肺 组织形态的影响(HE，×400)

2.2 大鼠心、肺病理学改变 见图1。对照组大鼠心肌纤维排列较为整齐紧密，染毒组大鼠的心肌纤维之间间隙增大，心肌细胞水肿明显。对照组肺组织的支气管结构清晰，其肺泡间隔无明显增宽，且无炎细胞浸润，肺泡腔内无明显的渗出及出血。而染毒组大鼠肺组织充血，肺间隔增厚、变宽，显微镜下可见巨噬细胞增生。

2.3 TGF-β1、p-Smad2/3表达的改变 TGF-β1、p-Smad2/3免疫组织化学染色阳性细胞的细胞核或细胞质内含有黄色或棕黄色颗粒(图2，图3)。染毒组大鼠的心、肺组织中TGF-β1(223，160)阳性细胞数均明显高于对照组(P<0.01)。肺组织中p-Samd2/3阳性细胞数(2.75)明显高于对照组(0.75，P<0.05)。而心脏中p-Smad2/3阳性细胞数(1.00)与对照组(0.75)未见明显差异(P>0.05)。

图2 纳米二氧化硅对大鼠心、肺细胞中 TGF-β1表达量的影响(DAB，×400)

图3 纳米二氧化硅染毒大鼠心、肺 p-Smad2/3组织学检查结果(DAB，×400)

3 讨 论

近年来，随着纳米二氧化硅在工业上的广泛应用及环境污染的日益严重，人群接触其的机会越来越多，纳米二氧化硅对人体的生物学效应也逐渐引起人们的关注。本研究证实一定浓度的纳米二氧化硅对大鼠具有明显的心肺损伤作用。有研究指出，环境中的纳米材料可通过呼吸道、皮肤、消化道进入哺乳动物体内，并通过淋巴循环及血循环到达全身各组织器官，引起机体广泛的生物学效应〔5,6〕。脏器系数常用于检测药物及毒物对实验动物的各脏器的影响，笔者测定了染毒大鼠的心肺脏器系数，显示10 mg/kg体重的纳米二氧化硅暴露30 d并未引起大鼠心肺脏器系数的明显变化，提示纳米二氧化硅对大鼠的损伤作用可能较为广泛，而非心、肺特异性损伤。

TGF-β信号转导通路在许多生理及病理过程中均发挥着重要的作用。其中，TGF-β1基因在正常组织细胞中处于沉默状态，当机体受到内外环境变化的影响而发生损伤时，组织细胞中的TGF-β1基因活化，并参与损伤组织的炎症反应及损伤修复过程〔7～9〕。通过体外划痕实验研究发现，给予TGF-β1能够促进胶原蛋白的生成及迁移〔10〕。Takano等〔11〕研究发现，Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE/Abca3给予TGF-β1 后，细胞形态发生明显改变，呈细长的成纤维细胞样；同时上皮细胞标志物细胞角蛋白(CK)19及Abca3表达量下降，间充质标志物如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增加，并促进了细胞板层体的形成。本实验结果证实，纳米二氧化硅染毒能够促进大鼠心、肺TGF-β1表达量的明显增多，说明纳米二氧化硅可能是通过激活TGF-β1信号转导通路而影响心、肺功能的。

p-Smad2/3是TGF-β1的重要下游信号分子，当TGF-β1与受体结合后，可以进一步活化细胞中的Smad2/3，使之磷酸化活化，并从细胞质向细胞核转移，将信号转至核内，引起相应基因表达改变〔12～14〕。本研究结果提示TGF-β1在不同的组织器官可能激活不同的下游信号分子，产生不同的损伤效应机制。

1 范玉兰,陶功华,肖 萍,等.Nrf-2在纳米二氧化硅致人支气管上皮细胞氧化损伤中的作用〔J〕.环境与职业医学，2014；31(4)：252-7.

2 Flaherty NL,Chandrasekaran A,del Pilar Sosa Pea M,etal.Comparative analysis of redox and inflammatory properties of pristine nanomaterials and commonly used semiconductor manufacturing nano-abrasives〔J〕.Toxicol Lett,2015；239(3):205-15.

3 Okoturo-Evans O,Dybowska A,Valsami-Jones E,etal.Elucidation of toxicity pathways in lung epithelial cells induced by silicon dioxide nanoparticles〔J〕.PLoS One,2013；8(9):e72363.

4 Musa M,Ponnuraj KT,Mohamad D,etal.Genotoxicity evaluation of dental nanocomposite using comet assay and chromosome aberration test〔J〕.Nanotechnology,2013；24(1):284-8.

5 Daughton CG,Ternes TA.Pharmaceuticals and personal care products in the environment:agents of subtle change〔J〕.Environ Health Perspect,1999；6(6):903-38.

6 Petrochenko PE,Kumar G,Fu W,etal.Nanoporous aluminum oxide membranes coated with atomic layer deposition-grown titanium dioxide for biomedical applications:an in vitro evaluation〔J〕.J Biomed Nanotechnol,2015；11(12):2275-85.

7 Sipilä KH,Ranga V,Rappu P,etal.Extracellular citrullination inhibits the function of matrix associated TGF-β〔J〕.Matrix Biol,2016；55(1):77-89.

8 彭海兵，王永恒，曹福源,等.熊果酸抑制矽肺大鼠转化生长因子β1、白介素1的表达及其作用机制〔J〕.环境与职业医学，2016；33(6)：567-70.

9 Thatcher SE.TGF-β signaling:new insights into aortic aneurysms〔J〕.Ebiomedicine,2016；10(16):30447-9.

10 Wu CS,Wu PH,Fang AH,etal.FK506 inhibits the enhancing of effects transforming growth factor(TGF)-β1 on collagen expression and TGF-β/Smad signalling in keloid fibroblasts:implication for new therapeutic approach〔J〕.Br J Dermatol,2012；167(3):532-41.

11 Takano M,Yamamoto C,Yamaguchi K,etal.Analysis of TGF-β1 and drug-induced epithelial-mesenchymal transition in cultured alveolar epithelial cell line RLE/Abca3〔J〕.Drug Metab Pharmacokinet,2015；30(1):111-8.

12 Sun X,Liu J,Zhuang C,etal.Aluminum trichloride induces bone impairment through TGF-β1/Smad signaling pathway〔J〕.Toxicology,2016；10(5):30237-42.

13 Peng FF,Xiao ZL,Chen HM,etal.Parathyroid hormone inhibits TGF-β/Smad signaling and extracellular matrix proteins upregulation in rat mesangial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016；478(3):1093-8.

14 Zhou Q,Zheng X,Chen L,etal.Smad2/3/4 Pathway contributes to TGF-β-induced MiRNA-181b expression to promote gastric cancer metastasis by targeting timp3〔J〕.Cell Physiol Biochem,2016；39(2):453-66.

〔2016-11-14修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

国家自然科学基金资助项目(No.81372952)；吉林省教育厅科研项目(No.2015407)

李 妍(1974-)，女，副教授，博士，主要从事神经毒理学相关机制研究。

陆 敏(1993-)，女，主要从事卫生毒理学研究。

R135.2

A

1005-9202(2017)09-2092-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.005

1 北京体育大学附属医院