不同保藏条件下广式烧鹅新鲜度变化及优势腐败菌的鉴定

郑玉玺 阮征 韩明 董蕾

摘要 [目的]探讨不同保藏条件下广式烧鹅新鲜度变化规律，并研究确定引起新鲜度急剧变化条件下的优势腐败菌及组成。[方法]广式烧鹅在不同温度和时间处理条件下，测定其挥发性盐基氮（TVB-N）含量，同时提取最优处理条件下广式烧鹅中细菌全基因组，对特异性扩增细菌16S rDNA V3可变区进行PCR扩增。扩增产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE），图谱分析样品中菌群结构。[结果]广式烧鹅在15 ℃条件下放置24～48 h、30 ℃放置12～36 h，TVB-N含量显著升高，表征新鲜度急剧下降；DGGE电泳结果表明，广式烧鹅在15和30 ℃条件放置12～48 h，葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、芽孢杆菌属（Bacillus Cohn.）为样品中优势菌属。[结论]在广式烧鹅保藏过程中，葡萄球菌属、乳酸片球菌、芽孢杆菌属为优势腐败菌，易造成污染且引起烧鹅的腐败变质及新鲜度的急剧下降。

关键词 变性梯度凝胶电泳；广式烧鹅；新鲜度；优势腐败菌

中图分类号 TS201.3 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2017）29-0068-04

Identification of Dominant Spoilage Bacteria of Cantonese Roasted Goose Freshness Changes under Variety Preservation Conditions

ZHENG Yuxi1，2，RUAN Zheng1，HAN Ming2 et al

（1.School of the Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong 510650； 2.Department of Food，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou，Guangdong 510600）

Abstract [Objective]To investigate the freshness of Cantonese Roasted Goose under the different condition of storage temperature and time，and determine the dominant spoilage bacteria which caused the freshness changes.[Method]Volatile basic nitrogen（TVBN） content，extraction of bacteria genome，the 16S rDNA of V3 variable region of bacterial by PCR specific amplification products，denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE） and bacterial community structure were determined.[Result]The results showed that the contents of TVBN were increased significantly under 24-48 h placed at 15 ℃ and 12-36 h placed at 30 ℃； Staphylococcus，Pediococcus acidilactici and Bacillus Cohn.were the dominant spoilage bacteria under 12-48 h placed at 15 and 30 ℃.[Conclusion]During the presevation of the Cantonese Roasted Goose，staphylococcus，Pediococcus acidilactici and Bacillus Cohn.were the dominant spoilage bacteria.

Key words Denaturing gradient gel electrophoresis fingerprint technology；Cantonese Roasted Goose；Freshness；Dominant spoilage bacteria

基金項目

2017年廣州市教育局首批高校产学研技术合作基地项目（Z1704517）。

作者简介 郑玉玺（1984—），男，安徽池州人，实验师，从事食品微生物相关研究。

收稿日期 2017-08-09

广式烧鹅是粤菜系中的传统名菜，因其营养丰富、滋味醇厚而深受人们喜爱[1]。由于烧鹅是传统风味食品，仍然保持着手工作坊式加工方式，且加工特点为整只烧制，受热不均匀，容易残留屠宰过程中污染的肠道菌；同时在包装、运输、售卖过程中没有严格的卫生控制措施，极易被细菌污染从而引起新鲜度下降甚至腐败变质，尤其是在年平均气温较高的南方地区，细菌更容易生长繁殖，由此带来的品质及安全问题日趋明显。目前对于广式烧鹅的卫生及贮藏研究鲜有报道，仅杨勇等[2]利用近红外光谱技术进行鹅肉新鲜度的快速测定，但是并未揭示引起这种新鲜度变化的微生物机制，对于引起烧鹅腐败变质的腐败菌及菌相组成也未见报道。

挥发性盐基氮（TVB-N）是一种碱性含氮物质，它的产生是由于动物性产品腐败过程中酶与细菌的作用，使蛋白质分解产生了大量的胺和氨类物质[3]。此类物质挥发性强，其含量越高，表明氨基酸[特别是蛋氨酸（Met）和酪氨酸（Tyr）]破坏程度越高，严重影响食品的营养价值。大量研究结果表明，TVB-N可用来表征肉类的新鲜度，其含量越高，肉类的新鲜度越低[4-5]。

传统的平板培养、分离、生化鉴定手段只能针对实验室可培养菌，但研究表明，自然界中可培养的微生物只占据微生物总量的1%。16S rDNA的PCR-变性梯度凝胶电泳（DGGE）作为核酸指纹图谱技术，能够分析样品中微生物多样性。它可根據16S rDNA中可变区序列，对样品中的微生物进行分类鉴定，避免了传统培养方法的局限性，可以准确地鉴定传统方法无法培养的微生物种群，能够直接、全面地了解微生物组成及菌群结构的动态变化[6]。

笔者以挥发性盐基氮作为广式烧鹅的新鲜度变化的指标，探讨在不同的处理温度和时间条件下烧鹅新鲜度的变化规律，同时采用PCR-DGGE指纹图谱技术分析引起烧鹅新鲜度变化的微生物种类及组成，确定不同保藏温度、时间条件下烧鹅的新鲜度及优势腐败菌组成，以期揭示广式烧鹅在保藏过程中品质变化与微生物种类及组成的关系，为实施更具针对性的防腐保鲜措施提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与主要试剂。广式烧鹅，购于华南理工大学校外快餐店；北京天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒；大连宝生物工程公司Taq DNA聚合酶、2 000 bp DNA Marker、引物合成；西班牙Sigma公司聚丙烯酰胺、尿素、去离子甲酰胺；美国Biotium公司GelRed核酸凝胶染色剂。

1.1.2 主要仪器设备。上海申安医疗器械厂LDZX-40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器；天津泰斯特仪器有限公司DH5000AB型电热恒温培养箱；德国Beckman公司高速冷冻离心机；北京君意东方电泳设备有限公司DGGE电泳分析系统；美国BIO-RAD公司PCR仪；广州美格生物有限公司DNA测序。

1.2 方法

1.2.1 样品处理。

烧鹅购买后放入无菌容器送回实验室，操作台无菌操作切碎混样，置于灭菌三角瓶中，保鲜膜封口后根据试验设计分组放置。

1.2.2 挥发性盐基氮的测定。

参照 GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》半微量定氮法[7]。

1.2.3 细菌全基因组提取。

无菌条件下准确称取10 g广式烧鹅（不同部位），剪碎后加入50 mL灭菌生理盐水，摇床振荡30 min。将混合溶液在4 ℃条件下500 r/min离心10 min。取上清液，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，弃上清。沉淀置于1.5 mL离心管中，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。

1.2.4 细菌16S rDNA的V3可变区扩增。

采用细菌通用引物（上游引物GC-F357，下游引物R518）对细菌16S rDNA的V3可变区进行PCR扩增（表1）。

PCR反应体系如表2所示。DNA扩增采用降落PCR，反应程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃ 变性30 s，65 ℃到55 ℃退火，每个循环降低0.5 ℃，退火30 s，72 ℃延伸30 s（此过程循环20次）；再以恒定退火温度（55 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行10个循环，最终72 ℃延伸10 min[8]。取5 μL PCR产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测含量及特异性后置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.5 DGGE分析。

PCR产物DGGE分析在DGGE电泳分析系统上进行。电泳条件：质量分数8%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺 ∶甲叉双丙烯酰胺=37.5 ∶1），变性梯度为30%到50%，PCR产物上样量20 μL，电泳温度恒定（60 ℃），1×TAE缓冲液中200 V预电泳10 min。80 V固定电压电泳8 h，Gel Red核酸凝胶染色剂1×TAE緩冲液中染色15 min，凝胶成像系统进行拍照保存。

1.2.6 DNA回收测序。

紫外灯条件下切下DGGE胶泳道中所需亮带，条带依照顺序放入已编号的1.5 mL EP管中，捣碎后加入30 μL ddH2O，-20 ℃浸泡过夜，离心，去上清进行PCR扩增。引物序列（上游引物F357，下游引物R518）在表1中显示。

扩增程序：94 ℃预变性4 min，30个循环（94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最终72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检验产量、测序。登陆NCBI，将所得序列与已知序列进行比较、相似性分析[8]。

1.3 数据统计分析

所得数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析，所得图像分析利用Quantity one 进行分析。

2 结果与分析

2.1 挥发性盐基氮含量变化

参考NY5034—2008《无公害食品禽肉及禽副产品》标准：禽肉及其制品TVB-N含量应低于150 mg/kg。由图1所示，在4、15及30 ℃ 3种贮藏温度下，广式烧鹅在整个贮藏期间的挥发性盐基氮含量均呈上升趋势，新鲜度下降，其中15、30 ℃分别放置48、36 h后均超过150 mg/kg标准，不能食用。4 ℃条件下TVB-N含量无显著性变化（P>0.5），放置72 h后仍未超过标准；30 ℃条件下，12～36 h期间TVB-N含量变化显著（P<0.5），新鲜度急剧下降，这是由于在适宜温度，样品中微生物处于对数生长期，大量繁殖消耗了样品中的蛋白质；15 ℃条件下，由于温度对微生物生长的影响，微生物生长迟滞期较长，导致TVB-N含量均低于30 ℃条件的同期水平；放置48 h后，由于微生物的生长繁殖进入了稳定期，消耗蛋白质的速率下降，且样品中的蛋白质消耗殆尽，而微生物消耗蛋白质的代谢产物碱性含氮物质与样品中酸性成分中和，导致30 ℃及15 ℃条件下的TVB-N都进入一个稳定的平台期。

由于TVB-N含量变化主要是因为微生物数量和组成的变化所导致的，因此选取30 ℃条件下0～36 h、15 ℃条件下0～48 h 2个区间进行PCR-DGGE指纹图谱分析，研究微生物菌群结构与新鲜度的关系。

2.2 细菌16S rDNA的V3可变区扩增结果

对所提取广式烧鹅中细菌组总DNA进行16S rDNA V3区PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖电泳检测，获得特异性扩增条带（图2）。电泳条带清晰，片段长度在200 bp左右，符合理论16S rDNA V3区长度，适宜进行DGGE电泳。

2.3 DGGE结果分析

在图3中显示为广式烧鹅中30 ℃条件下0、12和36 h及 15 ℃条件下0、24和48 h的DGGE电泳图。条带 a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l亮度相对较高（图3），是广式烧鹅样品中相对的优势菌群，割胶回收、测序比对。

条带a、b、d、f、h在S12-30、S36-30泳道中均为优势条带，而在S0中不是优势条带；条带c和e在S36-30泳道中是优势条带，而在 S12-30和S0不是优势条带，这表明30 ℃恒温处理下0 h（泳道S0）样品到12 h（S12-30）广式烧鹅中优势菌种类变化显著，而12 h至36 h（泳道S36-30）细菌组成及优势菌种类变化不显著。在泳道 S24-15和S48-15中，条带 j、k、d 和l比在泳道S0中相对较亮，是该处理下的优势条带。泳道 S24-15和S48-15中条带组成无明显差异，说明15 ℃恒温处理下，24和48 h时间点样品的细菌组成及优势菌的种类无明显差异。

对图3中标记较明显优势条带进行割胶回收、送样测序后，登陆NCBI与GenBank对已知序列进行BLAST比对分析，回收条带DNA序列对比同源性均达95%以上，序列结果如表3所示。

15和30 ℃处理下，不同时长的优势菌在表4中显示。可以看出，0 h（即烧鹅不经过处理）主要含有格氏乳球菌和芽孢杆菌属，组成较为简单。这是由于此时烧鹅刚刚经过热加工，所出现菌种可能为冷却时的人员或器具污染。但是在后续处理中没有发现格氏乳球菌，表明被其他种群抑制或竞争致死；而芽孢杆菌属在后续的每个处理中均检出，表明芽孢杆菌在广式烧鹅保藏中的重要性。

15 ℃条件处理24 h的样品中主要含有葡萄球菌属 （Staphylococcus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、芽孢

桿菌属（Bacillus），此时烧鹅TVB-N含量在第1个显著上升阶段（图1，P<0.5），对比0 h时菌群组成显著变化，表明这3种菌引起烧鹅新鲜度的下降；而在48 h时，菌群结构没有显著改变，但是TVB-N含量还在继续大幅度上升，说明这3种优势菌进入了对数生长期，数量增多，与其他弱势菌群竞争营养和生存环境，导致其他弱势菌群的消亡，同时由于生长繁殖的需要，消耗样品中大量蛋白质产生TVB- N，导致TVB-N含量显著上升（图1，P<0.5），烧鹅新鲜度下降。

30 ℃条件处理12 h的样品中主要含有葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳杆菌属（Lactobacillales bacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus），与15 ℃条件下的变化趋势相似，新鲜度进入第1个显著下降期，但时间提前12 h，且TVB-N含量上升幅度比15 ℃条件下更显著（图1，P<0.5）。这是由于温度相对较高，适宜微生物生长繁殖，较早进入对数生长期且生长繁殖数量较高；处理36 h后主要含有葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳杆菌属（Lactobacillales bacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、丛毛单胞菌属（Comamonassp），此时进入烧鹅新鲜度的第2个显著下降期（图1），检出丛毛单胞菌属。

3 结论

广式烧鹅15 ℃条件下放置24～48 h、30 ℃放置12～36 h，TVB-N含量显著升高（图1），新鲜度急剧下降，失去营养价值并伴有食物中毒的风险，不建议继续食用。

引起广式烧鹅新鲜度变化的主要微生物种群为葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳酸片球菌属（Pediococcus acidilactici）、芽孢杆菌属（Bacillus）、丛毛单胞菌属（Comamonassp），其中影响较大种属为葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳酸片球菌属（Pediococcus acidilactici）。

该研究探讨了广式烧鹅在保藏过程中新鲜度变化的规律，并分析了新鲜度急剧变化条件下的优势腐败微生物，这将有利于准确预测广式烧鹅的货架期，同时也将为广式烧鹅的包装或保藏提供更具针对性的依据。

参考文献

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