植物系统与进化枇杷属内栽培种和部分野生种ITS序列分析

陈灼娟

摘要： 對不同栽培区的25种普通枇杷品种以及7种枇杷属野生种的ITS序列进行扩增并测序，采用邻接法和最大简约法进行系统发育树的构建并对枇杷属内不同种间的遗传关系进行了分析。结果表明：枇杷属植物ITS序列ITS1+5.8S rDNA+ITS2总长度为592 bp或594 bp，长度变化发生在ITS2。所有样本的ITS1和5.8S rDNA长度一样，都是223 bp和168 bp；而ITS2为201 bp或203 bp。5种枇杷属野生种的ITS序列长度为594 bp，包括栎叶枇杷、大渡河枇杷、南亚枇杷、南亚枇杷窄叶变种和大瑶山枇杷；其余2种枇杷属野生种（麻栗坡枇杷、小叶枇杷）和普通枇杷栽培种的ITS序列长度都为592 bp。所有样本ITS序列的GC含量为64.2%～64.5%，其中ITS1为64.1%～65.5%，ITS2为68.1%～72.6%。对所有样本的ITS序列比对产生44个可变位点，其中38个为简约信息位点，其中11个位于ITS1，5个位于5.8S rDNA，22个位于ITS2。最大的种间序列差异为7.7%，最小的种间差异发生在麻栗坡枇杷和小叶枇杷之间，仅为0.2%。普通枇杷种内的ITS序列差异很低，25种普通枇杷栽培种之间的序列差异为0～1.5%。所研究的枇杷属植物可分为3个分支。分支Ⅰ包括所有普通枇杷品种，分支Ⅱ包含5种野生枇杷种，包括栎叶枇杷、大渡河枇杷、南亚枇杷、南亚枇杷窄叶变种和大瑶山枇杷；分支Ⅲ由2个野生枇杷种（麻栗坡枇杷、小叶枇杷）组成。该研究结果表明ITS序列对枇杷种间鉴定和系统发育分析具有一定意义，但对普通枇杷栽培种间的鉴定作用不大。

关键词： 枇杷属， ITS序列， 变异位点， 系统发育

中图分类号： Q781，Q949

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）11144708

Abstract： Internal transcribed spacer （ITS1， 5.8S rDNA and ITS2） regions of seven wild Eriobotrya species and twentyfive loquat （E. japonica） cultivars were cloned and sequenced. The phylogenetic tree was constructed by the Neighborjoining method and the maximum parsimony method， and phylogenetic relationships of different species of were studied in this work. The size of the ITS1+5.8S rDNA+ITS2 sequences was 592 bp or 594 bp. The length variation was found in ITS2. The length of ITS1 and 5.8S rDNA for all sample were identical， with a value of 223 bp and 168 bp. While ITS2 was 201 bp or 203 bp. The experimental data obtained from five wild Eriobotrya plants（E. prinoides， E. prinoides var. daduheensis， E. bengalensis， E. bengalensis f. angustifolia， E. dayaoshanensis） showed the same sequence length of 594 bp， while the others were 592 bp. Variation of GC contents has been also observed and scored as 64.1%-65.5% and 68.1%-72.6% for ITS1 and ITS2. The alignment of all the ITS sequences from Eriobotrya plants produced 44 variable sites with 38 parsimony of informative sites （ 11 in ITS1， 5 in 5.8S rDNA and 22 in ITS2 ）. The greatest interspecific sequence divergence was 7.7%. The lowest value （0.2%） occurred between E. malipoensis and E. seguinii showed the similar ITS sequence. We found that divergence among loquat （E. japonica） cultivars sequence was very low. The intraspecific sequence variabilities between twentyfive loquat （E. japonica） cultivars were 0-1.5%. All phylogenetic trees， by the Neighborjoining method and the maximum parsimony method， confirmed these Eriobotrya plants could be divided into three major clades. Clade Ⅰ contained all loquat （E. japonica） cultivars. Clade Ⅱ contained five wild species of Eriobotrya （E. prinoides， E. prinoides var. daduheensis， E. bengalensis， E. bengalensis f. angustifolia， E. dayaoshanensis）. Clade Ⅲ consisted of E. malipoensis and E. seguinil formed a basel clade. ITS data failed to resolve internal relationship within the Clade Ⅰ， an important clade since all loquat （E. japonica） cultivars analysed were in this clade. Our results strongly supported the efficiency of ITS sequence for the genetic diversity among Eriobotrya species， but use ITS sequence to identify the variety of loquat （E. japonica） cultivars did not appear to help.

Key words： Eriobotrya， ITS sequence， variation point， phylogeny

枇杷属（Eriobotrya Lindl.）属于蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae），有27～30种，主要分布在东亚和东南亚地区。普通枇杷（Eriobotrya japonica）由于其可食性而广为人知。在中国，关于枇杷的记载可追溯到2000年前，中国拥有丰富的枇杷种质资源，种类多、分布广。在古代，枇杷就被引种到国外，现在枇杷已在世界其他地区普遍种植（Soriano et al，2005）。为理解枇杷属植物的分布和分类情况，学术界进行了大量的研究工作。在中国有大量的野生枇杷种质资源，并不断有新的枇杷种被发现（Lin，1999）。但由于对野生枇杷的研究较少以及缺乏快速有效的鉴定工具，造成枇杷属内种类的一些混乱（杨向晖等，2005）；而普通枇杷由于长期以来不同区域间经常相互引种栽培，果农自行定名推广，导致枇杷品种出现同物异名和同名异物的混乱现象。所以，枇杷属内植物的遗传评价和物种鉴定对于资源的保护和利用尤为重要。

传统的系统发育分析基于形态学特征进行，随着分子生物学的发展，一些生物学标志如同工酶（方德秋和章恢志，1989）、等位酶（蔡礼鸿等，2005）、RAPD（Vilanova et al，2001）、AFLP（吴锦程等，2006）、SSR（Soriano et al，2005）等已被用于枇杷遗传多样性和种质鉴定研究中。ITS序列具有进化速率快、稳定性好和测序方便的优点，成为研究植物系统发育及分子进化的有效工具和重要标记，被广泛应用于植物属间、种间以及种内各栽培种间分类研究（Alvarez & Wendel，2003）。本研究测定了25种普通枇杷栽培种及7种枇杷属野生种的ITS序列，并进行枇杷属系统发育分析，研究枇杷属内分类学关系，为枇杷属物种多样性保护、种质鉴别和栽培育种提供分子生物学工具和依据。

1材料与方法

1.1 材料

植物材料均采自国家果树种质福州枇杷资源圃，包括25种普通枇杷栽培种，代表国内外不同的枇杷栽培区，还采集了7种枇杷属野生种，采集时均采集树上嫩叶，并立即保存于液氮中备用， 品种名称、原产地详见表1。本研究选取了与枇杷属亲缘关系近的苹果属的Malus fusca（GenBank No：AF186514）和李属的Pyrus ussuriensis（GenBank No：EU150058）作为外类群。

OMEGA E.Z.N.A HP plant DNA Kit、OMEGA E.Z.N.A Gel Extraction Kit购自福州博鸿生物科技有限公司；即用PCR扩增试剂盒及部分药品购自上海生工生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。ITS引物采用White et al（1990）设计的通用引物ITS1和ITS4，引物ITS1和引物ITS4分别位于18S和28S rDNA片段上，可扩增全长ITS1、5.8S rDNA和ITS2序列。

1.2 方法

1.2.1 枇杷叶基因组DNA的提取和检测液氮中研磨枇杷叶至粉末，应用E.Z.N.A HP plant DNA Kit进行DNA提取，具体操作参照试剂盒说明书。提取到的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2 PCR扩增PCR扩增应用上海生工即用PCR试剂盒进行，反应体系包含25 μL 2 × PCR Master （含MgCl2）、1 μL Primer ITS1（20 μmol·L1）、1 μL Primer ITS4（20 μmol·L1）、50 ng枇杷叶基因组DNA。反应程序为94 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30 cycles；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR产物回收与测序PCR产物使用OMEGA E.Z.N.A Gel Extraction Kit进行回收纯化，回收产物直接测序，测序工作委托上海生工生物工程有限公司进行。

1.2.4 数据分析ITS1、5.8S和ITS2的边界由已知Eriobotrya japonica ITS序列（GenBank No：U16192）和近缘种已经发表的ITS序列来界定，利用CLUSTAL X v.1.81（Thompson et al，1997）进行序列排列，并进行手工校正。利用MEGA v.4.0.2（Tamura et al，2007）对ITS1、5.8S和ITS2三个区域GC含量和核苷酸替代率进行计算，并根据Kimura二参数模型构建邻接树。此外，还利用PAUP 4.0 beta 10 win（Swafford，2002）软件对所有序列进行最大简约树的构建，所有特征状态指定为无序（random），空位作缺失（missing）状态分析。最大简约树的构建使用启发式（heuristic）搜索（100随机添加序列重复），树二等分再连接分支交换（TBR），各种核苷酸替代同等加权，使用自展法（bootstrap）检验MP树可靠性（重复1 000次）。

2结果与分析

2.1序列长度和GC含量

本研究中所有样品ITS序列已提交至GenBank，详见表1。通过对序列长度和GC含量分析发现，所研究枇杷属植物整个ITS序列包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2长度为592 bp或594 bp（表2）。其中，来自5种野生枇杷：南亚枇杷（Eriobotrya bengalensis）、南亚枇杷窄叶变种（E. bengalensis f. angustifolia）、栎叶枇杷（E. prinoides）、大渡河枇杷（E. prinoides var. daduheensis）、大瑶山枇杷（E. dayaoshanensis）的ITS序列长度都为594 bp。其余2种野生枇杷：麻栗坡枇杷（E. malipoensis）和小叶枇杷（E. seguinii）及25种普通枇杷（E. japonica）栽培種的ITS序列长度都为592 bp。长度变异区域发生在ITS2区，变异发现为一个GC的插入（图1）。所研究的枇杷属植物的ITS序列GC含量在64.2%～64.5%之间，其中ITS1为64.1%～65.5%，ITS2为68.1%～72.6%。

2.2 序列差异性

本研究所采集的枇杷属植物的ITS序列比对发现存在44个变异位点，信息位点为38个，其中11个位于ITS1，5个在5.8S，22个位于ITS2。种间最大的序列差异为7.7%，最小的差异是在麻栗坡枇杷和小叶枇杷之间，仅有0.2%。栎叶枇杷和大渡河枇杷序列同源率为99.3%，南亚枇杷和南亚枇杷窄叶变种序列同源率为99.2%，序列数据差异与其品种分类一致。

研究发现在普通枇杷各品种间的ITS序列差异较小，差异值在0～1.5%之间；差异位点发生在ITS2，大部分栽培种表现为相同的ITS序列，表明ITS序列在普通枇杷种内具有高度保守性。

2.3 ITS序列的系统发育分析

本研究基于ITS序列构建了枇杷属内系统发育树。邻接树应用 Kimura二参数法构建 （图2）。在应用最大简约法构建系统树过程中，启发性搜索（heuristic searches）产生95棵最大简约树，其一致性指数（CI）为0.884 2，保留指数（RI）为0.938 9（图3）。这两种方法构建的系统树都把本研究所采集的样品分为3个分支。第一个分支（Clade Ⅰ）包含了所有的普通枇杷品种，包括栽培种和一些野生种，处于该分支基部的是栽培种贵州野生，由于普通枇杷种内ITS序列差异较小，故系统树并没有将这些品种完全分开。第二分支（Clade Ⅱ）包含栎叶枇杷、大渡河枇杷、南亚枇杷、南亚枇杷窄叶变种和大瑶山枇杷，这5种枇杷都是枇杷属内的野生种。第三分支（Clade Ⅲ）中包含麻栗坡枇杷和小叶枇杷，这个分支处于整个系统树的基部。

3讨论

3.1 ITS的进化

枇杷属植物的ITS1序列长度为223 bp，ITS2比ITS1短20 bp或22 bp。得到的枇杷属植物ITS序列的总长与其他被子植物特别是蔷薇科植物相近（ITS1：187～298 bp，ITS2：187～252 bp）（Campbell et al，1995）。枇杷属ITS序列比对的结果显示长度变异发生在ITS2，表现为1个GC的插入，这种插入可能是基因滑动，一种DNA错配突变过程的结果（Gillespie，2004）。

在枇杷属植物中，ITS2的GC含量比ITS1高2%～5%；ITS2的差异水平比ITS1高出两倍。这表明ITS2进化速度比ITS1快（Torres et al，1990）。在普通枇杷种内ITS1几乎相同而变异位点都处在ITS2区，也验证了这个结论。

3.2 ITS序列在枇杷属系统发育分析中的应用

ITS序列的变异速率为许多被子植物类群的系统发育研究提供了较丰富的变异位点和信息位点。在蔷薇科（Rosaceae）植物中，ITS序列已经成功应用于苹果亚科（Maloideae）（Campbell et al，1995）、唐棣属（Amelanchier）（Campbell et al，1997）、苹果属（Malus）（Robinson et al，2001）、梨属（Pyrus）（Zheng et al，2008）等植物类群的系统发育分析中。目前，在分子水平对枇杷属系统发育学的研究还较少。DNA序列比对可以让我们深入认识枇杷属各种之间的系统发育关系。本研究的主要目的是将ITS序列分析引入到枇杷属遗传关系评估体系中。本研究所采集枇杷属植物的ITS序列比对发现比对矩阵存在44个可变位点，其中信息位点为38个，这表明ITS序列在对枇杷種间的鉴定与关系评估具有可观的价值。ITS序列分析也显示了某些枇杷栽培种在形态学上差异较大，而在DNA水平上同源性却很高。ITS序列的分析可以提供给我们一个方便的评估枇杷种间关系的工具。但是，在普通枇杷栽培种之间，ITS序列的差异性很小，表明这些栽培种在遗传关系上非常相近。这也可能是因为这些栽培种都来自同一祖先，而相互之间杂交频繁。应用ITS序列无法将所有的栽培种分开，故ITS序列无法有效应用于普通枇杷栽培种进行品种鉴定。通过ITS序列分析枇杷属种间遗传关系，可以有目的地选择亲缘关系较远的非栽培种作为亲本进行杂交育种，使优良、独特基因得到有效转移。

3.3 普通枇杷的起源

在枇杷属系统发育学研究中，普通枇杷的起源是一个富有争议的课题。方德积和章恢志（1989）在大渡河流域发现一种新的枇杷野生种，命名为大渡河枇杷，在研究大渡河枇杷形态学、孢粉学及同工酶后，认为大渡河枇杷可能是普通枇杷的祖先之一；而唐蓓（1997）在对普通枇杷、大渡河枇杷和栎叶枇杷的核型及过氧化物同工酶分析后，认为大渡河枇杷可能来源于普通枇杷与栎叶枇杷的杂交种；杨向晖等（2007）基于RAPD和AFLP对普通枇杷、大渡河枇杷和栎叶枇杷进行的研究支持了后者关于大渡河枇杷是栎叶枇杷和普通枇杷杂交种的观点。本研究发现大渡河枇杷与栎叶枇杷在ITS序列上同源率非常高，而与普通枇杷的亲缘关系较远，故支持大渡河枇杷是栎叶枇杷一个变种的观点。但是，关于大渡河枇杷是普通枇杷祖先的观点还需进一步论证。

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