Akt/GSK-3β通路介导调控莱菔硫烷减轻心脏移植缺血再灌注损伤的研究*

伊雪，杨学慧，杨述亮，石莺，邬鹏宇，王耕银，陈乃耀，高木火，高毅哲，李占清

[1.厦门医学院 病理与病理生理学教研室，福建 厦门 361008；2.华北理工大学附属医院 胸心外科，河北 唐山 063000；3.福建省厦门市第二医院（厦门医学院附属医院）胸心外科，福建 厦门 361021]

Akt/GSK-3β通路介导调控莱菔硫烷减轻心脏移植缺血再灌注损伤的研究*

伊雪1，杨学慧2，杨述亮2，石莺1，邬鹏宇2，王耕银2，陈乃耀2，高木火3，高毅哲3，李占清3

[1.厦门医学院 病理与病理生理学教研室，福建 厦门 361008；2.华北理工大学附属医院 胸心外科，河北 唐山 063000；3.福建省厦门市第二医院（厦门医学院附属医院）胸心外科，福建 厦门 361021]

目的探讨蛋白激酶B（Akt）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信号通路对莱菔硫烷（SFN）预处理减轻大鼠心肌冷缺血再灌注损伤（IRI）的作用机制。方法64例健康雄性SD大鼠随机分为4组：IRI组、SFN组、阻滞剂LY294002+IRI（LY+IRI）组、阻滞剂LY294002+SFN预处理（LY+SFN）组，将冷藏于心肌保护液（组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液）9 h的供体心脏移植到受体大鼠的腹腔，复制同种大鼠异体异位心脏移植模型，术后24 h取供体心脏心肌组织，采用免疫组织化学法（IHC）和Western blot检测Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、GSK-3β、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）蛋白的表达。结果IHC法和Western bolt检测各种蛋白结果显示，与IRI组比较，SFN组p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达升高（P<0.05）。应用阻滞剂LY294002后，SFN+LY组与LY+IRI组的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论SFN能通过Akt/GSK-3β信号通路减轻心脏移植心肌冷缺血再灌注损伤。

蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β通路；莱菔硫烷；心脏移植；冷缺血再灌注损伤

心脏移植缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是不可避免的。如何减轻心脏移植的缺血再灌注损伤，提高患者远期存活率是目前研究的焦点之一。前期研究发现，莱菔硫烷（Sulforaphane，SFN）通过抗凋亡、抗氧化作用能减轻心脏移植供体心脏冷缺血再灌注损伤[1-2]，但机制不甚清楚。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/糖原合成激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）通路作为细胞内重要信号通路在心肌暖缺血再灌注损伤中的保护作用已得到证实[3-5]。然而，Akt/GSK-3β通路在SFN减轻心肌缺血再灌注损伤的作用机制还不得而知。故本实验拟通过复制大鼠异体异位心脏移植模型，探讨SFN是否通过Akt/GSK-3β通路减轻供体心脏冷缺血再灌注损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

近交系健康雄性SD大鼠64例（北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXX京2011-007），体重220～250 g，SPF清洁级。SFN购于美国LKT实验室，LY294002（PI3K阻滞剂）购自美国Cayman公司，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液（histidine-tryptophan-ketoglutarate，HTK）购自德国克勒化学试剂公司，PV-600免疫组织化学二步法检测试剂盒购自北京中杉金桥公司，兔Akt、磷酸化Akt（以下简称p-Akt）多克隆抗体购自美国Abcam公司。GSK-3β、磷酸化GSK-3β（以下简称p-GSK-3β）多克隆抗体均购自香港Affinity公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶剂购于美国Sigma公司。

1.2 模型复制

按照李占清等[1]描述的方法进行动物模型复制。步骤如下：①麻醉。10%水合氯醛3～4 ml/kg腹腔注射，麻醉SD大鼠。②供体心脏制备。用4℃生理盐水35 ml和HTK液15 ml先后对供体心脏进行冲洗并取出置于20ml 4℃ HTK液中保存9h。③受体移植。将供体心脏的升主动脉、肺动脉分别与受体大鼠的腹主动脉、下腔静脉端侧吻合，开放循环，心脏复跳，检查无出血后关腹。④标本采集。移植后24 h处死动物，取其供体心脏的心肌组织，一部分石蜡包埋待组织学和免疫组织化学检测，一部分置于-80℃深低温冰箱中冷冻待Western blot检测。

1.3 实验分组

64例健康雄性SD大鼠随机分为4组（每组供、受体各8例），①IRI组：受体在移植前24 h经尾静脉注射1%DMSO 0.3 ml；②SFN组（莱菔硫烷预处理组）：受体在移植前24 h经尾静脉注射SFN（溶于DMSO溶剂）2.5 mg/kg；③LY+IRI组（阻滞剂LY2940 02+IRI组）：受体于注射1%DMSO前30 min及移植前30 min分别经鼠尾静脉注射LY294002（溶于1%DMSO）0.3 mg/kg，余同IRI组；④LY+SFN组（阻滞剂LY294002+菔硫烷预处理组）：受体于注射SFN前30 min及移植前30 min分别经鼠尾静脉注射LY294002 0.3 mg/kg，余同SFN组。

1.4 检测指标

1.4.1 免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）半定量分析Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达 按照试剂盒说明书，采用PV-6001免疫组织化学二步法检测Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β的蛋白表达。石蜡切片常规脱蜡至水，放入沸腾的柠檬酸盐缓冲液中抗原热修复5 min，3%过氧化氢阻断内源过氧化物酶后磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，3 min/次，分别滴加兔多克隆抗体Akt（1∶50）、p-Akt（1∶50）、GSK-3β（1∶200）、p-GSK-3β（1∶200），置于4℃冰箱冷冻过夜，次日滴加PV-6001试剂，37℃温箱孵育40 min，PBS冲洗3次，3 min/次，行二氨基联苯氨显色5～6min后蒸馏水充分洗涤，再行苏木素复染1min后流水冲洗30 min，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；用已知阳性组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，光镜下观察，心肌细胞细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性表达。于400倍镜下，每张切片取5个视野，按照伊雪等[6]的免疫组织化学评分法，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色程度进行评分，取均值表示该蛋白表达。

1.4.2 Western bolt检测Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达 蛋白提取：取出冷冻供体心脏组织，切取100 mg放入冰上已编号的离心管（eppendorf tubes，EP）管中，加入混匀的细胞裂解液1 ml，用匀浆器打碎，置于4℃、11 000 r/min离心10 min，并用微量枪析出上清液备用。应用聚氰基丙烯酸正丁酯法蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度（A液∶B液=50∶1，混匀）并用上样缓冲液配平，配制12%分离胶注入制胶玻璃板待凝固，再次注入5%浓缩胶并插梳子，凝固后拔出梳子并滴加上样蛋白（50μg/孔），放入电泳槽进行电泳，用电转仪将蛋白转至聚偏氟乙烯膜，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）清洗3次，5 min/次，用5%脱脂奶粉封闭2 h，再次TBST液清洗3次，10 min/次，孵一抗并4℃冰箱过夜，次日TBST液清洗3次，15 min/次，孵二抗2 h，TBST液清洗3次，15 min/次，并显影，待β-actin（1∶10 000）检测平衡后，依次检测Akt、P-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达（均1∶1 500），应用Image JV 1.47H软件进行条带灰度值测定。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量数据以均数±标准差（±s）表示，应用单因素方差分析（One-way，ANOVA），若方差齐则两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植后24 h供体心脏心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达

各组Akt、GSK-3β蛋白表达比较，经方差分析，差异无统计学意义（F=0.086和0.493，P=0.951和0.691）；各组p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=48.482和12.805，P=0.000）。SFN组与IRI组的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达比较，差异有统计学意义（P<0.05）。应用阻滞剂LY294002后，LY+IRI组与SFN+LY组的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1和图1、2。

2.2 Western bolt检测移植后24 h供体心脏心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达

各组Akt、GSK-3β蛋白表达比较，经方差分析，差异无统计学意（F=0.076和0.120，P=0.971和0.946）；各组p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=5.881和18.064，P=0.020和0.001）。SFN组与IRI组的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达比较，差异有统计学意义（P <0.05）。应用阻滞剂LY294002后，LY+IRI组与SFN+LY组的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2和图3。

表1 移植后24 h供体心脏心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达比较（IHC）（n=8，±s）

表1 移植后24 h供体心脏心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达比较（IHC）（n=8，±s）

注：1）与SFN组比较，P<0.05；2）与IRI组比较，P<0.05；3）与LY+ SFN组比较，P<0.05

组别p-GSK-3β IRI组 4.25±0.16 5.30±0.371） 4.77±0.33 4.37±0.311）SFN组 4.32±0.23 7.27±0.402）3） 4.94±0.24 5.29±0.352）3）LY+IRI组 4.27±0.26 5.00±0.381） 4.95±0.21 4.47±0.221）LY+SFN组 4.27±0.16 5.25±0.361） 4.85±0.36 4.43±0.241）F值 0.086 48.482 0.493 12.805 P值 0.951 0.000 0.691 0.000 Akt p-Akt GSK-3β

图1 心脏移植后24 h各组供体心脏心肌组织p-Akt蛋白的表达 （IHC×400）

图2 心脏移植后24 h各组供体心脏心肌组织p-GSK-3β蛋白的表达 （IHC×400）

表2 移植后24 h供体心脏心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达比较（Western bolt）（n=8，±s）

表2 移植后24 h供体心脏心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达比较（Western bolt）（n=8，±s）

注：1）与SFN组比较，P<0.05；2）与IRI组比较，P<0.05；3）与LY+ SFN组比较，P<0.05

组别p-GSK-3β IRI组 1.21±0.05 1.00±0.061） 1.12±0.15 0.96±0.231）SFN组 1.25±0.09 1.53±0.032）3） 1.15±0.16 1.75±0.062）3）LY+IRI组 1.21±0.04 0.98±0.081） 1.16±0.10 0.97±0.171）LY+SFN组 1.23±0.09 0.98±0.111） 1.09±0.15 0.98±0.181）F值 0.076 5.881 0.120 18.064 P值 0.971 0.020 0.946 0.001 Akt p-Akt GSK-3β

图3 心脏移植后24h供体心脏心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达（Western bolt）

3 讨论

GSK-3β作为细胞内PI3K/Akt信号通路主要的下游靶分子，属丝/苏氨酸蛋白激酶家族，GSK-3有 2种高度同源异构体（GSK-3α、GSK-3β）。GSK-3α主要调节肝糖原代谢；GSK-3β主要调节骨骼肌、心脏糖原合酶的代谢。目前研究发现，GSK-3β具有调节细胞功能、物质代谢及维持细胞骨架完整性的作用[7-9]。对于GSK-3β的调节主要是通过GSK-3β的磷酸化、非磷酸化状态及与GSK-3β结合蛋白的相互作用而实现。GSK-3β的激活主要是通过N-末端的丝氨酸残基Ser9的磷酸化实现，但激活后GSK-3β的生物活性却明显降低甚至丧失，即磷酸化GSK-3β处于失活状态。GSK-3β的激活受体内多种激酶的调节，其中最主要的是来自于上游Akt的调节[10-11]。因此，许多对细胞存活起调节作用的因子能够通过PI3K/Akt信号转导通路的介导作用于GSK-3β，使其磷酸化，从而抑制其生物学活性，最终达到促细胞生存的目的。大量研究发现，预处理、后处理及药物处理等均可通过激活PI3K/Akt信号通路进而使GSK-3β磷酸化失活，从而对IRI的心肌起保护作用[10-14]。因此激活PI3K/Akt/GSK-3β信号转导通路将是保护IRI组织及细胞的新思路。根据本实验结果，SFN可能是通过激活Akt，失活下游靶因子GSK-3β，从而对心肌的冷IRI起保护作用。因此笔者认为在心脏移植中，SFN可能是通过激活Akt/GSK-3β信号通路对心肌冷IRI起保护作用。但SFN抗凋亡、抗氧化作用的机制尚需进一步研究。

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（童颖丹 编辑）

Sulforaphane preconditioning attenuates myocardial cold ischemia reperfusion injury of heart transplantation of rats through Akt/GSK-3β signaling pathway*

Xue Yi1,Xue-hui Yang2,Shu-liang Yang2,Ying Shi1,Peng-yu Wu2,Geng-yin Wang2, Nai-yao Chen2,Mu-huo Gao3,Yi-zhe Gao3,Zhan-qing Li3
[1.Department of Pathology and Pathophysiology,Xiamen Medical College,Xiamen,Fujian 361008,China;2.Department of Cardiothoracic Surgery,the Affiliated Hospital,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;3.Department of Cardiothoracic Surgery,the Second Hospital of Xiamen(the Affiliated Hospital of Xiamen Medical College),Xiamen,Fujian 361021,China]

ObjectiveTo explore the role of Akt/Gsk-3β signaling pathway in sulforaphane(SFN)protecting rats from cold myocardial ischemia-reperfusion injury during heart transplantation.Methods Sixty-four health male Sprague-Dawley (SD)rats were randomly divided into 4 groups,i.e.ischemia reperfusion injury group (IRI group),sulforaphane group (SFN group),LY294002+ischemia reperfusion injury (LY+IRI group),and LY294002+sulforaphane group (LY+SFN group).Isogeneic heterotopic heart transplantation model was estab－lished according to Li's method.Donor hearts storaged in histidine-tryptophan-ketoglutarate solution for 9 h were transplanted into the abdominal cavities of recipient rats to establish rat models of heterotopic heart transplantation.Akt,p-Akt,GSK-3β and p-GSK-3β protein expressions in the grafts were detected by immunohistochemistry and Western bolt 24 h after reperfusion.ResultsCompared with the IRI group,p-Akt and p-GSK-3β levels increased in the SFN group(P<0.05).After using blocker LY294002,there was no significant difference in the expression of p-Akt or p-GSK-3β between the LY+SFN group and the LY+IRI group (P>0.05).ConclusionsSFN reduces cold ischemia reperfusion injury in heart transplantation of rats through activating Akt/GSK-3β signaling pathway.

Akt/Gsk-3β signaling pathway;sulforaphane;heart transplantation;cold ischemia reperfusion injury

R654.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.002

1005-8982（2017）09-0008-05

2015-10-12

福建省自然科学基金（No：2016D014）；福建省医学创新课题（No：2015-CXB-47）；福建省厦门市科技惠民项目（No：3502Z2016 4057）

李占清，E-mail：zhanqingli@163.com