MALDI-TOF MS技术在鉴定临床少见非发酵菌中的应用

周宋元，黄颖，徐元宏

（安徽医科大学第一附属医院 检验科，安徽 合肥 230022）

MALDI-TOF MS技术在鉴定临床少见非发酵菌中的应用

周宋元，黄颖，徐元宏

（安徽医科大学第一附属医院 检验科，安徽 合肥 230022）

目的评价基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术在快速鉴定临床少见非发酵菌中的应用价值。方法选取2013年7月-2016年10月安徽医科大学第一附属医院检验科分离的67株临床少见非发酵菌，包括痰液分离的21株，尿液分离的13株，血液分离的9株，骨髓液分离的9株，分泌物分离的8株，腹透液分离的2株，脑脊液分离的1株，胆汁分离的1株，其他体液分离的3株。以16S核糖体RNA（16SrRNA）序列分析为金标准，比较MALDI-TOF MS与Vitek2 Compact鉴定系统鉴定的准确性。结果67株临床少见非发酵菌中，MALDI-TOF MS将66株（98.5%）鉴定到种水平，1株（1.5%）鉴定到属水平；Vitek2 Compact鉴定系统将59株（88.1%）鉴定到种水平，8株（11.9%）未能鉴定；67株少见非发酵菌均扩增到16SrRNA目的基因片段并成功测序，67株（100.0%）都成功鉴定到种水平。以16SrRNA序列分析为金标准，MALDITOF MS和Vitek2 Compact鉴定系统正确鉴定到种水平准确性分别为98.5%（66/67）和88.1%（59/67）。结论与传统的细菌生化反应方法相比，MALDI-TOF MS技术操作简便、耗时短、费用低，鉴定结果与16SrRNA序列分析的符合率高，可以提高临床对少见非发酵菌鉴定的准确率。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；非发酵菌；鉴定

临床上分离的常见非发酵菌以铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等为主[1-2]，对较少分离的非发酵菌目前用传统的生化反应方法鉴定，影响因素较多，鉴定结果不理想。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年来应用于临床病原微生物快速鉴定的一项新技术，不同的细菌经MALDI-TOF MS系统检测可形成特异性的蛋白图谱，将待测细菌的蛋白图谱与已有图库进行比对，即可确定细菌种属。本研究应用Vitek2 Compact鉴定系统、MALDI-TOF MS技术及16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA，16SrRNA）序列分析3种方法对67株临床少见非发酵菌进行鉴定比较，以评估质谱技术在鉴定临床少见非发酵菌中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 实验菌株

选取2013年7月-2016年10月于安徽医科大学第一附属医院检验科分离的67株临床少见非发酵菌，包括痰液分离的21株，尿液分离的13株，血液分离的9株，骨髓液分离的9株，分泌物分离的8株，腹透液分离的2株，脑脊液分离的1株，胆汁分离的1株及其他体液分离的3株。剔除同一患者相同部位的重复菌株。所有菌株转入菌种液置入-80℃冰箱冷冻保存，统一检测。

1.2 实验仪器与试剂

VITEK2 COMPACT全自动细菌鉴定仪及配套革兰阴性细菌鉴定卡（法国生物梅里埃公司），VITEK MS质谱仪（法国生物梅里埃公司），细菌DNA抽提试剂盒与聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司），PCR扩增仪（德国Biometra公司），电泳仪（北京六一仪器厂），凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），数显恒温水浴锅（金坛市江南仪器厂），超速低温离心机（美国Sigma公司），-80℃超低温冰箱（日本SANYO公司）。

1.3 质控和校准菌株

质控：大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、嗜麦芽窄食单胞菌ATCC 17666；校准：大肠埃希菌 ATCC 8739。菌株均采购于国家卫生和计划生育委员会临床检验中心。

1.4 细菌分离培养及鉴定

1.4.1 VITEK2 COMPACT鉴定 按常规方法[3]进行细菌分离培养，挑取纯菌落配0.5麦氏浊度的菌悬液，再用VITEK2 COMPACT全自动微生物鉴定仪及配套的革兰阴性细菌鉴定卡进行菌种鉴定。

1.4.2 MALDI-TOF MS鉴定 ①靶板制备：取1μl一次性接种环将新鲜的校准菌株大肠埃希菌ATCC 8739涂在质谱仪靶板的校准位点，取新鲜的待测纯菌落涂在各个测试靶点上，每个靶点滴加1μl α-氰基-4-羟基肉桂酸基质液，待菌株完全干燥后上机。②上机分析：在电脑上输入靶板号与标本号，点击传输到仪器系统软件，仪器打开舱门，将靶板放入靶板槽，待仪器门关闭完成，仪器开始自动分析。软件自动与数据库（VITEK MS-IVD数据库V2.0版本）中已知菌种的蛋白图谱进行比对，从而得出最终鉴定结果。

1.4.3 16SrRNA序列分析 将细菌鉴定系统鉴定过的纯菌落接种于配置好的肉汤中，置入35℃温箱中摇菌（200 r/min）过夜，取过夜菌悬液在室温下8 000 r/min离心1 min，取沉淀物严格按照细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂盒步骤提取细菌DNA。参照相关文献[4]，选用16SrRNA细菌通用引物，配PCR体系50μl，进行扩增。27F正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。取PCR产物8μl加入1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察，确认目标基因扩增成功，PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司，结果参照美国临床和实验室标准协会MMl8-A解释的标准[5]在美国国立生物技术信息中心核酸数据库中进行比对。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计数资料以百分比（%）表示，用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准菌株鉴定结果

质控菌株经PCR扩增后电泳凝胶系统成像均在1 500 bp处获得阳性产物，与预期片段大小吻合。所测序列与核酸数据库中的相应菌株比对分析结果完全符合。见图1、2。

2.2 67株实验菌株电泳结果

16SrRNA基因PCR扩增后电泳凝胶系统成像均在1 500 bp处获阳性产物，与预期片段大小吻合。见图3。

图1 质控菌株电泳图

图2 大肠埃希菌ATCC 25922蛋白质谱图

图3 部分实验菌株电泳图

表1 Vitek2 Compact、MALDI-TOF MS及16sRNA序列分析鉴定在种水平一致的菌株

2.3 Vitek2 Compact系统、MALDI-TOF MS及16SrRNA序列分析结果比较

2.3.1 Vitek2 Compact系统与MALDI-TOF MS比较 67株临床少见非发酵菌株，其中59株（88.1%）Vitek2 Compact系统与MALDI-TOF MS鉴定结果在种水平一致，5株（7.5%）Vitek2 Compact系统与MALDI-TOF MS鉴定结果在属水平不一致；Vitek2 Compact系统无法鉴定的菌株有8株（11.9%），MALDI-TOF MS只鉴定到属水平的有1株（1.5%）。两种鉴定技术比较，经配对χ2检验，差异有统计学意义（χ2=12.319，P=0.000），提示两种鉴定技术一致性或关联性较好。两种鉴定技术优势性比较，差异无统计学意义（χ2=0.800，P=0.371）。见表1～3。

表2 Vitek2 Compact、MALDI-TOF MS及16sRNA序列分析鉴定在属水平不同的菌株

表3 Vitek2 Compact无法鉴定菌株与MALDI-TOF MS、16sRNA序列分析鉴定菌株比较

2.3.2 进一步鉴定分析 该67株临床少见非发酵菌均扩增到16SrRNA目的基因片段并成功测序，67株（100%）都鉴定到种水平。以16SrRNA序列分析为金标准，其中Vitek2 Compact鉴定系统将临床少见非发酵菌正确鉴定到种水平准确性为88.1%（59/67），而MALDI-TOF MS正确鉴定到种水平准确性较高，为98.5%（66/67）。见图4～6。

图4 人苍白杆菌蛋白质谱图

图5 皮氏罗尔斯顿菌蛋白质谱图

图6 食酸代尔夫特菌蛋白质谱图

3 讨论

非发酵菌是一大群条件致病菌，最近几年来，由于抗生素的不合理使用导致本来为条件致病菌的非发酵菌成为重要的临床致病菌，广泛播散[6]。目前，传统的微生物鉴定技术已经很难满足临床的需求，检验科微生物室急需一种简便、高效、快速的鉴定方法。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术作为一种新兴的微生物鉴定技术，在国内外广受关注[7-12]。MALDI-TOF MS技术于2011年获得欧洲共同体体外诊断认证，2012年8月获得中国CFDA注册证，2013年8月获得美国FDA认证，意味着应用MALDI-TOF MS技术的质谱仪真正进入临床微生物和患者诊疗。许多研究都对MALDI-TOF MS技术进行评价，认为其在临床微生物领域有广阔的应用前景，值得期待。MALDI-TOF MS技术是利用已有的蛋白质谱指纹库中的信息或建立新的蛋白质谱指纹库数据，通过比较待测菌株与标准菌株的质谱图而对微生物的种属进行鉴定[13-14]。

本研究应用MALDI-TOF MS、16SrRNA序列分析及Vitek2 Compact鉴定系统同时对67株临床少见非发酵菌进行鉴定，根据实验结果数据分析评价MALDI-TOF MS技术在快速鉴定临床少见非发酵菌中的应用价值。实验提示，MALDI-TOF MS技术正确鉴定到种水平的鉴别能力高于Vitek2 Compact鉴定方法。而Vitek2 Compact与MALDI-TOF MS方法无法鉴定的疑难细菌，使用16SrRNA序列分析均能成功鉴定。这与叶乃芳等[15]做的90株临床疑难细菌的质谱鉴定与Vitek2 Compact鉴定比较的结论一致。

本研究收集的少见非发酵菌标本，数量较少，有待后续的研究中收集多家医院相关菌株，进一步评估MALDI-TOF MS技术在鉴定少见非发酵菌的应用价值。

尽管MALDI-TOF MS技术在鉴定临床微生物中已经得到广泛认可，但是还有很多影响其鉴定结果的因素，如基质的选择、样品的前处理方式、数据库的完善等，应该引起学者日常工作的重视[16]。所以在临床微生物检验中建立规范化的培养、恰当的样品处理方式和标准的质谱分析操作流程，将能提高质谱技术鉴定的准确性。

综上所述，与传统的细菌生化反应方法相比，MALDI-TOF MS技术操作简便、耗时短、费用低，鉴定结果与16SrRNA序列分析的符合率高，可以提高临床对少见非发酵菌鉴定的准确率。临床上应不断完善细菌蛋白图谱数据库，从而进一步提高对细菌的鉴定水平。

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（童颖丹 编辑）

Application of matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry technique for identification of rare non-fermentative bacteria in clinic

Song-yuan Zhou,Ying Huang,Yuan-hong Xu
(Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei,Anhui 230022,China)

ObjectiveTo evaluate the application value of matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)technique in the rapid identification of rare non-fermentative bacteria.MethodsFrom July 2013 to October 2016,67 clinical isolates of rare non-fermentative bacteria were collected from the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,which included 21 strains isolated from sputum,13 strains from urine,9 strains from blood,9 strains from bone marrow,8 strains from secretions,2 strains from peritoneal dialysis fluid,1 strain from cerebrospinal fluid,1 strain from bile,and 3 strains from other body fluids.According to the gold standard of 16SrRNA sequence analysis,the accuracy of the identification system of MALDI-TOF MS and Vitek2 Compact was compared.ResultsIn the 67 strains of bacteria,MALDI-TOF MS technique identified 66 strains(98.5%)to species level and 1 strains(1.5%)to genus level;while Vitek2 Compact identified 59 strains(88.1%)to species level,and 8 strains(11.9%)failed to identify.16SrRNA gene fragments were amplified from the 67 strains of experimental bacteria and successfully sequenced,all of the strains were identified to species level.Using 16SrRNA sequence analysis as thegold standard,the accuracy of MALDI-TOF MS system and Vitek2 Compact system for identification at the species level was 98.5%(66/67)and 88.1%(59/67)respectively.ConclusionsCompared with traditional bacteria biochemical reaction method,MALDI-TOF MS technique is simple,rapid and inexpensive.Its accuracy of identification result is highly consistent with that of 16SrRNA sequence analysis,MALDI-TOF MS technique can improve the accuracy of clinical identification of non-fermentative bacteria.

matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry;non-fermentative bacteria;identification

R371；R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.014

1005-8982（2017）09-0069-05

2016-11-07

徐元宏，E-mail：xyhong1964@163.com；Tel：13505694447