快速进入高海拔地区对大鼠小肠电活动及小肠Cajal间质细胞微观结构和功能的影响

贺 巍，朱 琳，杨生岳，范兴爱，刘睿年，魏廷青

解放军第四医院消化内科，青海 西宁 810007

快速进入高海拔地区对大鼠小肠电活动及小肠Cajal间质细胞微观结构和功能的影响

贺 巍，朱 琳，杨生岳，范兴爱，刘睿年，魏廷青

解放军第四医院消化内科，青海 西宁 810007

目的快速进入高原后，不同海拔高度及时间点下大鼠小肠电活动变化及其对小肠Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)微观结构和功能的影响。方法130只SD雄性大鼠随机分为低海拔地区组(A组，海拔400 m)、中度海拔地区组(B组，海拔2 260 m)和高海拔地区组(C组，海拔4 300 m)，B、C组又以进入高原地区后的时间划分为1 d、3 d、5 d、7 d、10 d和14 d组，每组10只大鼠。测定各组大鼠空肠电活动数据，并应用免疫荧光染色及电子显微镜观察小肠ICC的功能及微观结构变化。结果大鼠小肠电波幅及波频在中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组行到最低点(P<0.05)，且高海拔地区3 d组受损伤更加明显(P<0.05)。小肠ICC的功能及微观结构也可同步观察到类似改变，于中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组受损伤最明显，电镜下可观察到ICC的缝隙连接减少、细胞器减少并出现凋亡小体等，并以高海拔地区3 d组最显著。用c-kit免疫荧光标记同部位ICC，也可观察到中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组免疫荧光强度最低(P<0.05)，且高海拔地区3 d组降低更显著(P<0.05)。结论快速进入高原对于大鼠小肠电活动影响显著，且海拔高度越高大鼠小肠电活动受损越严重，下行速度越快。大鼠小肠ICC微观结构及功能也出现相应同步损伤，表明ICC可能在快速进入高原胃肠动力紊乱形成机制中广泛参与并发挥重要作用。

高原病；高海拔；胃动力；Cajal间质细胞；大鼠

近年来随着经济及交通的发展，因旅游、科研、训练等原因进入青藏高原地区活动的人越来越多[1]，而高原所固有的恶劣自然环境对机体造成很多负面影响，从而引发呼吸、循环、神经、消化等多系统损伤，造成机体功能紊乱[2]。快速进入高原胃肠动力紊乱是高原胃肠应激反应的主要表现之一，通常以腹胀、恶心、呕吐、腹泻、食欲减退等消化道症状最为突出，一般经7～10 d的高原适应后逐渐减轻或消失[3]。

当前有关高原胃肠动力紊乱的研究多以应用B超、X线钡餐、激素测定、内镜等检查手段观测高原应激时的胃肠动力变化为主，而从基础研究出发详细探讨高原胃肠动力紊乱变化规律的报道尚少见[4]。研究[5-7]表明Cajal间质细胞(interstitial cell of Cajal, ICC)具有产生、传播慢波的功能，在胃肠道动力的产生及调控中发挥关键作用，目前已成为研究胃肠动力的热点及焦点。那么快速进入高原后大鼠小肠运动发生紊乱时，其小肠电活动是如何发生变化的，小肠ICC的微观结构及功能是否也存在相应改变，它们之间有何关联变化，将成为是我们研究的重点。本实验将测定快速进入高原不同海拔、不同时间点下，大鼠小肠电活动变化情况，并使用电子显微镜及免疫荧光标记的方式，观察快速进入高原对大鼠小肠ICC微观结构及功能的影响，为进一步探讨快速进入高原胃肠动力紊乱的发生机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器兔抗大鼠多克隆c-kit抗体(LifeSpan BioSciences公司)，羊抗兔IgG alexa fluor 594单克隆抗体(美国Jackson公司)，FV 1000激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)，TecnaiG2分析透射电镜(美国FEI公司)，超低温冰箱(-80 ℃)及超低温切片机(美国Nuair公司)，RM6280B生物信号采集处理系统(成都仪器厂生产)。

1.2 实验动物和分组购自西安交通大学实验动物中心SD大鼠130只，雄性，体质量(200±20)g，SPF级，许可证号：SCXK(陕)2012-003，所有大鼠随机分为3大组，13小组。即以实验地区海拔高度划分3大组，低海拔地区组(A组，西安，海拔400 m)、中度海拔地区组(B组，西宁，海拔2 260 m)、高海拔地区组(C组，玛多，海拔4 300 m)。另以大鼠起运后3 d内进驻实验现场模拟快速进入高原状态，并以进驻后的时间点为依据，依达到实验地区后的时间顺序于B、C两组下设6个亚组，即：1 d、3 d、5 d、7 d、10 d和14 d组，每组10只大鼠。

1.3 小肠电生理活动检测SD大鼠术前12 h禁食，术前6 h禁水，戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，通过大鼠腹部正中切开，选择大鼠幽门后10 cm处小肠浆膜层埋置引导电极[8]，测量小肠电活动变化，参数设定为“生物电，200 μV，0.02 s，100 Hz”，记录波形并分析。

1.4 实验标本的采集与固定电生理测定完成后处死大鼠，剪开胸腔，经升主动脉插管，快速灌入生理盐水冲去血液，于大鼠幽门后10 cm小肠处截取0.2 cm×0.1 cm大小组织，放入3%戊二醛固定用于电镜染色，后继续经升主动脉先快后慢灌注冷的(4 ℃)，4%多聚甲醛0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH 7.4)500 ml，注毕立即截取大鼠幽门后10～15 cm段置于20%的蔗糖溶液中过夜沉底。

1.5 电镜观察大鼠小肠ICC微观结构变化取3%戊二醛固定后组织用0.2 mol/L蔗糖磷酸缓冲液漂洗，再用2%的四氧化锇后固定1 h，丙酮中梯度脱水，在1%醋酸双氧铀中停滞染色1 h，再通过环氧丙烷与环氧树脂。1 mm切片用亚甲蓝染色，在光镜下观察，确定黏膜层、环形肌层、纵行肌层，再次经70 nm超薄切片后先用酒精醋酸双氧铀、再用柠檬酸盐后染色，保留纵行肌层、环形肌层、黏膜下层、部分黏膜层，用透射电镜观察、照相。

1.6 免疫荧光化学法标记ICC并观察、采集图像取固定后小肠段0.4 cm×0.2 cm组织用超低温切片机切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS反复漂洗3次后，置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室温)，再经0.01 mol/L PBS液漂洗后进行免疫组织化学荧光染色(以c-kit抗体标记ICC)：加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗体(1∶150)孵育24 h(室温)，经0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，所有切片均加入羊抗兔IgG alexa fluor 594单克隆抗体(1∶300)，避光孵育2 h(室温)。经0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片，以上过程均需避光操作。各组切片各取10张，在FV1000激光共聚焦显微镜下采用20倍及40倍视野观察，观察每一张切片取6～8个视野，并将数字化图像储存。

2 结果

2.1 快速进入高原后大鼠小肠在中度海拔及高海拔地区各时间段下的电生理变化海拔高度对小肠电活动影响十分显著，随着海拔高度的升高，肠的放电波频及波幅受损下行越明显(见表1～2、图1)。在进入中度海拔地区后第1 d，小肠电波频、波幅均发生显著变化(P<0.05)，并于5 d组出下行到最低点(P<0.05)，而后缓慢恢复。高海拔地区小肠电波幅、波频变化与之相类似，于3 d组(P<0.05)下行到最低点，且其与中度海拔5 d组相对比，小肠电波幅及波频下降更加显著(P<0.05)。

组别1d3d5d7d10d14d低海拔组579.31±15.46-----中度海拔组348.88±64.77*249.69±56.22214.42±34.32**282.07±54.91297.88±61.99398.69±47.87高海拔组174.85±42.88*△122.91±29.64##△△147.86±25.79175.99±38.22194.17±34.11222.41±42.74

注：与低海拔组比较，*P<0.05；与中度海拔3 d组及7 d 组比较，**P<0.05；与高海拔1 d组及5 d组比较，##P<0.05；与中度海拔1 d组比较，△P<0.05；与中度海拔5 d组比较，△△P<0.05。

组别1d3d5d7d10d14d低海拔组49.23±1.16-----中度海拔组49.02±1.2348.29±1.68*47.28±1.99*,**49.07±1.0449.33±0.8349.45±0.89高海拔组47.61±1.61*△44.76±0.52##△△48.31±1.848.95±1.3648.96±1.41 49±1.31

注：与低海拔组比较，*P<0.05；与中度海拔3 d组及7 d组比较，**P<0.05；与高海拔1 d组及5 d组比较，##P<0.05；与中度海拔1 d组比较，△P<0.05；与中度海拔5 d组比较，△△P<0.05。

注： 1: 1 d；2: 3 d；3: 5 d；4: 7 d；5 : 10 d；6: 14 d。

图 1 大鼠快速进入高海拔地区后胃电活动时程变化

A：低海拔组(400 m)；B：中度海拔组(2 260 m)；C：高海拔组(4 300 m)

Fig 1 Expression of ascending to high altitude on small intes-tine electrical activity in rats

A: low altitude (400 m); B: moderate altitude (2 260 m); C: high altitude (4 300 m)

2.2 快速进入高原后大鼠在中度海拔及高海拔地区各时间段下小肠ICC的微观结构变化低海拔组ICC在电镜下观察可见：细胞结构完整，缝隙连接紧密，核周细胞质充盈，细胞器数量较多，细胞内部罕见空泡样改变，无凋亡小体。快速进入高原地区后，细胞微观结构受外界环境影响、受损，尤其在中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组表现最为明显。ICC细胞缝隙连接变得松散、减少；核周细胞质空泡样改变加重，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；细胞内细胞器数量明显减少，细胞线粒体可见空泡样肿胀，部分可见内质网轻度扩张；部分形成核固缩，核内可见异染色质，凋亡小体明显增多；更严重的可见尚存细胞的连接结构明显破坏，连接松散，核周胞质显著减少，线粒体肿胀变性，空洞随处可见，核内可见大量凋亡小体及异染色质(见图2)。

注： 1: 1 d；2: 3 d；3: 5 d；4: 7 d；5 : 10 d；6: 14 d。

图2 大鼠快速进入高海拔地区后对小肠ICC微观结构的影响

A：低海拔组(400 m)；B：中度海拔组(2 260 m)；C：高海拔组(4 300 m)

Fig 2 Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the rats’ small intestine

A： low altitude (400 m); B: moderate altitude (2 260 m); C: high altitude (4 300 m)

2.3 快速进入高原后大鼠在中度海拔及高海拔地区各时间段下小肠c-kit表达的变化不论是中度海拔地区还是高海拔地区，与低海拔组相比，大鼠小肠c-kit表达明显下降，1 d组即出现明显变化(P<0.05)，且进入地区的海拔高度越高下降幅度越快，中度海拔地区于5 d组到达最低点(P<0.05)，高海拔地区于3 d组下行到最低点(P<0.05)，而后缓慢恢复。且海拔越高影响越严重，高海拔地区3 d组与中度海拔地区5 d组比较c-kit表达强度明显减弱(P<0.05)(见表3、图3)。

组别1d3d5d7d10d14d低海拔组46.50±1.84-----中度海拔组36.50±1.81*34.14±1.8633.84±1.84**34.38±1.8336.24±1.8136.41±1.87高海拔组33.04±1.78*△31.73±1.86##△△32.45±1.7133.02±1.8633.38±1.7834.91±1.85

注：与低海拔组比较，*P<0.05；与中度海拔3 d组及7 d组比较，**P<0.05；与高海拔1 d组及5 d组比较，##P<0.05；与中度海拔1 d组比较，△P<0.05；与中度海拔5 d组比较，△△P<0.05。

注： 1: 1 d；2: 3 d；3: 5 d；4: 7 d；5 : 10 d；6: 14 d。

图3 大鼠快速进入高海拔地区后对小肠c-kit表达影响变化图(Aa、B4、C3：Bar=100 μm,40×; 其余：Bar=200 μm, 20×)

A：低海拔组(400 m)；B：中度海拔组(2 260 m)；C：高海拔组(4 300 m)

Fig 3 Expression of ICCs in rats’ small intestine by ascending to high altitude(Aa,B4,C3：Bar=100 μm,40×; Rest：Bar=200 μm, 20×)

A: low altitude (400 m); B: moderate altitude (2 260 m); C: high altitude (4 300 m)

3 讨论

由低海拔地区快速进入高海拔地区，或有高海拔地区快速进入更高海拔地区，极易诱发低张性缺氧，人体会调整体内血液分布，通过收缩皮肤及胃肠道血管用以保障心、脑等重要脏器的供养，进而造成一系列消化道症状。高原胃肠应激反应是急性高原病的常见表现，消化系统功能障碍甚至能够进一步加重其他原发高原疾病的病情，造成严重后果[9]。目前在高原胃肠动力紊乱的研究领域，有关胃肠电节律规律性变化的研究、报道尚不多。已知的研究表明ICC作为慢波的起源细胞可与肠神经系统(enteric nervous system, ENS)及消化道平滑肌(smooth muscle cell, SMC)形成网络状连接，并组成胃肠动力的基本功能单位(basically functional unit GI motility, BFUGM)[10]，它同时与抑制性和兴奋性神经纤维形成紧密连接，在ENS和SMC之间进行信息传递[4]，进而影响胃肠的基本电节律，并以此来调控胃肠运动[11-14]。近年来大量的研究表明，诸多胃肠动力障碍疾病的患者存在ICC功能的损伤，如：糖尿病胃轻瘫、慢性便秘、功能性消化不良等[15-17]，其主要表现在ICC数量的减少、缺失及ICC网络的受损及神经递质分泌异常等，并最终导致慢波的异常，进而引起胃肠动力疾病或障碍。可以看出在胃肠动力障碍疾病的研究领域中，ICC的地位不容忽视，十分重要。 通过观察快速进入高原后大鼠的小肠电活动的规律变化，可以发现不同的海拔高度对大鼠小肠的电活动有十分明显影响，进入地区的海拔高度越高，小肠电的波幅及波频受损越严重。进入中度海拔地区后第1天，小肠电波频、波幅均发生显著变化，第5天出下行到最低点后缓慢恢复。试验表明高海拔地区小肠电波幅、波频变化类似，不同于第3天下行到最低点，且与中度海拔5 d组相对比，小肠电波幅及波频下降更加显著。此外，使用电子显微镜观察各组大鼠小肠ICC微观结构的变化，并结合ICC表达量的变化进行分析，可以发现类似的损伤变化规律，即快速进入高原大鼠小肠电活动受损变化时，ICC的微观结构及表达量也同步发生损伤变化，海拔高度越高，ICC微观结构受损越严重，代表ICC表达量的免疫荧光强度值越低，并同样于中度海拔5 d组、高海拔3 d组下行到最低点，且后者下降幅度更大，恢复更慢。可见大鼠进入高海拔地区后，其小肠电活动变化与小肠ICC微观结构及功能变化存在明显的关联性，因此我们分析急速进入高海拔地区后，在小肠动力紊乱的发生机制中，ICC细胞可能广泛参其中与并发挥重要作用，这将为我们以后进一步探讨快速进入高原胃肠动力紊乱的发生机制提供基础理论依据。

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(责任编辑：马 军)

Effects of ascending to high altitude on small intestine electrical activity, ultrastructure and function of interstitial cells of Cajal in the rats

HE Wei, ZHU Lin, YANG Shengyue, FAN Xing’ai, LIU Ruinian, WEI Tingqing

Department of Gastroenterology, the Fourth Hospital of PLA, Xining 810007, China

Objective To study the influence of different altitudes and time points on small intestine electrical activity, the ultrastructure and physiological function of interstitial cells of Cajal (ICCs) in high altitude exposed rats.Methods One hundred and thirty SD male rats were divided into three groups. Group A was located in low altitude (400 m), and group B was located in moderate altitude (2 260 m), and group C was located in high altitude (4 300 m). On the basis of time points after entering the plateau, group B and C were further divided into six sub-groups, including groups of 1 day, 3 days, 5 days, 7 days, 10 days, and 14 days. Each group contained 10 rats. Rats’ small intestine electrical activity in different groups were measured. Immunofluorescence staining and electron microscopic were used to observe the physiological function and ultrastructure of ICCs in the small intestine.Results The amplitude and frequency of small intestine electrical activity of rats were the lowest in moderate altitude 5 days group and high altitude 3 days group (P<0.05). The reduction in high altitude 3 days group was more obvious (P<0.05). The physiological function and ultrastructure of ICCs were damaged in the small intestine. The gap junctions and organelles of ICCs were reduced in moderate altitude 5 days group and high altitude 3 days group, and apoptotic bodies were observed by electron microscope. The injury of rats in high altitude 3 days group was more obvious (P<0.05). The injury of high altitude on ICCs was also confirmed by c-kit immunofluorescence in moderate altitude 5 days group and high altitude 3 days group.Conclusion The small intestine electrical activity in rats was significant influenced by high altitude exposure, and the injury was more serious in higher altitude. The ultrastructure and function of ICCs in the small intestine was impaired in the same group. The results indicated that the ICCs played an important role in the small intestine dynamic disorders in high altitude exposed rats.

Mountain sickness; High altitude; Gastric motility; Interstitial cell of Cajal; Rat

青海省(应用)基础研究项目(2013-Z-760)

贺巍，副主任医师，硕士，研究方向：功能性胃肠病。E-mail:hewei.1971@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.02.021

R574

A 文章编号：1006-5709(2017)02-0191-05

2016-05-27